一种半纤维素降解酶系共表达菌株及其构建方法与应用技术

本发明专利技术涉及一种半纤维素降解酶系共表达菌株及其构建方法与应用，属于基因工程技术领域

【技术实现步骤摘要】
一种半纤维素降解酶系共表达菌株及其构建方法与应用


[0001]本专利技术涉及一种半纤维素降解酶系共表达菌株及其构建方法与应用，属于基因工程

。

技术介绍

[0002]在大肠杆菌中使用单个或多个质粒融合表达两种或两种以上酶已经被广泛研究
。
但是使用多质粒进行融合表达时，往往需要加入不同抗生素施加不同选择压力来保持质粒稳定
。
在单细胞中的单酶表达与多酶融合表达相比，可以减少不正确折叠而形成包含体的可能性，同时可以提高酶活
。
[0003]中国专利文献
CN 104152392 A(
申请号
201410374667.8)
公开了一种基于半纤维素酶的工程菌及其实现方法，以灰略红链霉菌基因组
DNA
经过全基因合成构建得到的
pUC57
‑
XL
载体为模板，与含有酶切位点的引物进行
PCR
扩增并对应分别得到编码木聚糖酶的核苷酸序列
XL
和编码木糖苷酶的核苷酸序列
XO
；然后将扩增得到的基因序列依次连接到共表达载体
pETDuet
‑1，最终重组共表达载体
pETDuet
‑
XL
‑
XO
；之后将该重组共表达载体转化到大肠杆菌表达菌株内，获得转基因共表达菌株
。
该专利技术能够应用基因工程手段实现木聚糖酶和木糖苷酶体外的大量表达合成，最终实现半纤维素的原位快速降解
。
[0004]中国专利文献
CN 102994542 A(
申请号
201210562444.5)
提供了一种新型的共表达源自宇佐美曲霉
(Aspergillus usamii)E001
阿魏酸酯酶
A
基因和
β
‑1，4‑
木聚糖酶基因的工程菌
GS115/faeA
‑
xyn11A
的构建方法
。
所构建成的毕赤酵母共表达系统可用于阿魏酸酯酶和
β
‑1，4‑
木聚糖酶的工业化生产
。
所制备的两种酶具有底物亲和力强
、
催化效率高的特性，具有较大的工业化生产潜力和经济价值
。
[0005]目前的研究中，单质粒融合表达木质纤维素酶时多为两种蛋白酶，两种以上蛋白酶的研究相对较少，两种以上蛋白酶共表达时，不同的表达顺序对于表达量及酶活性的影响也是鲜为人知的
。

技术实现思路

[0006]针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种半纤维素降解酶系共表达菌株及其构建方法与应用
。
本专利技术在单质粒中构建了包括木糖苷酶编码基因
Xys、
阿魏酸酯酶编码基因
FaeLam
和木聚糖酶编码基因
N20Xyl
的半纤维素降解酶系共表达重组质粒，并优化了酶系的表达顺序，构建半纤维素降解酶系共表达菌株，实现了胞外酶的高表达及木质纤维素的高效降解
。
[0007]本专利技术的技术方案如下：
[0008]一种半纤维素降解酶系共表达重组质粒，所述半纤维素降解酶系共表达重组质粒包括木糖苷酶编码基因
Xys、
阿魏酸酯酶编码基因
FaeLam
和木聚糖酶编码基因
N20Xyl
，所述木糖苷酶编码基因
Xys
的核苷酸序列为
SEQ ID NO.1
，所述阿魏酸酯酶编码基因
FaeLam
的核苷酸序列为
SEQ ID NO.2
，所述木聚糖酶编码基因
N20Xyl
的核苷酸序列为
SEQ ID NO.3。
[0009]根据本专利技术优选的，所述重组质粒的半纤维素降解酶系表达顺序为
Xys
‑
FaeLam
‑
N20Xyl
或
FaeLam
‑
Xys
‑
N20Xyl。
[0010]根据本专利技术优选的，所述重组质粒的载体质粒为
pETDuet
‑
1。
[0011]本专利技术中一种优选的技术方案，表达顺序为
Xys
‑
FaeLam
‑
N20Xyl
的半纤维素降解酶系共表达重组质粒的构建方法，包括如下步骤：
[0012](1)
以质粒
pETDuet
‑
FaeLam、pETDuet
‑
N20Xyl
为模板，通过
PCR
扩增分别得到
FaeLam
片段和
N20Xyl
片段，将
FaeLam
片段和
N20Xyl
片段重叠拼接得到
FaeLam
‑
N20Xyl
片段；
[0013](2)
将步骤
(1)
得到的
FaeLam
‑
N20Xyl
片段插入到质粒
pETDuet
‑
Xys
中，构建得到半纤维素降解酶系共表达重组质粒
pETDuet
‑
Xys
‑
FaeLam
‑
N20Xyl。
[0014]本专利技术中一种优选的技术方案，表达顺序为
FaeLam
‑
Xys
‑
N20Xyl
的半纤维素降解酶系共表达重组质粒的构建方法，包括如下步骤：
[0015]1)
以质粒
pETDuet
‑
Xys、pETDuet
‑
N20Xyl
为模板，通过
PCR
扩增分别得到
Xys
片段和
N20Xyl
片段，将
Xys
片段和
N20Xyl
片段重叠拼接得到
Xys
‑
N20Xyl
片段；
[0016]2)
将步骤
1)
得到的
Xys
‑
N20Xyl
片段插入到质粒
pETDuet
‑
FaeLam
中，构建得到半纤维素降解酶系共表达重组质粒
pETDuet
‑
FaeLam
‑
Xys
‑
N20Xyl。
[0017]一种含有上述半纤维素降解酶系共表达重组质粒的半纤维素降解酶系共表达菌株
。
[0018]根据本专利技术优选的，所述半纤维素降解酶系共表达菌株的宿主菌为大肠杆菌
。
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种半纤维素降解酶系共表达重组质粒，其特征在于，所述半纤维素降解酶系共表达重组质粒包括木糖苷酶编码基因
Xys、
阿魏酸酯酶编码基因
FaeLam
和木聚糖酶编码基因
N20Xyl
，所述木糖苷酶编码基因
Xys
的核苷酸序列为
SEQ ID NO.1
，所述阿魏酸酯酶编码基因
FaeLam
的核苷酸序列为
SEQ ID NO.2
，所述木聚糖酶编码基因
N20Xyl
的核苷酸序列为
SEQ ID NO.3。2.
如权利要求1所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒的半纤维素降解酶系表达顺序为
Xys
‑
FaeLam
‑
N20Xyl
或
FaeLam
‑
Xys
‑
N20Xyl
；优选的，所述重组质粒的载体质粒为
pETDuet
‑
1。3.
一种含有权利要求1所述的半纤维素降解酶系共表达重组质粒的半纤维素降解酶系共表达菌株
。4.
如权利要求3所述的半纤维素降解酶系共表达菌株，其特征在于，所述半纤维素降解酶系共表达菌株的宿主菌为大肠杆菌；进一步优选的，所述大肠杆菌为木糖代谢缺陷型大肠杆菌；更进一步优选的，所述木糖代谢缺陷型大肠杆菌为木糖异构酶
XylA
与木酮糖激酶
XylB
编码基因敲除菌
。5.
权利要求3所述的半纤维素降解酶系共表达菌株在制备含有木糖苷酶
、
木聚糖酶和阿魏酸酯酶的多酶混合物中的应用
。6.
权利要求3所述的半纤维素降解酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐振上，王婷，张夙夙，王家朋，
申请(专利权)人：齐鲁工业大学山东省科学院，
类型：发明
国别省市：