一种滇紫草植株再生的方法技术

本发明专利技术涉及一种通过愈伤组织再生滇紫草植株的方法。其操作步骤主要包括：１）滇紫草胚性愈伤组织的诱导；２）胚性愈伤组织的继代培养；３）胚性愈伤组织丛生芽的分化；４）丛生芽的扶壮和根的诱导；５）炼苗和移栽。本发明专利技术能够获得高繁殖系数的胚性愈伤组织，获得的滇紫草再生植株成活率高，生长状态良好，可应用到大规模培育滇紫草人工植株的实际生产过程中。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种通过愈伤组织再生滇紫草植株的方法。
技术介绍
滇紫草(Onosma paniculatum Bur. et Fr.)主产云南，是云南省本地常用中草药， 属紫草科(Boraginaceae)植物，其根药用。主要有效成分为紫草素及其衍生物，这些成分 不但具有抗菌、抗炎、抗癌等多种药理作用，还作为天然色素广泛用于医药、化妆品和印染 工业。目前，滇紫草的野生资源破坏严重，市场上供需矛盾凸显。虽然利用植物细胞大规 模培养技术在反应器中直接培养细胞获得药用次生代谢产物是生产植物药的新技术和新 方法，但细胞培养成本和技术含量都较高，难以大范围推广应用。相比较而言，通过愈伤组 织再生滇紫草人工种苗，进而采用传统药材种植方式解决药材短缺问题是直接而实际的手 段。这种通过愈伤组织获得种苗的方法不受季节和生境的限制，可人为控制，具有自然有性 繁殖不可比拟的优势。总的来说，获得一种高频、快速、稳定的植株再生体系是保证高生产 效率，低生产成本的必要手段。紫草科植物的人工种植已有成功的范例，如在东北地区大规模种植的紫草属植物 硬紫草(Lithospermum erythrorhizon Sieb. et Zucc.)，但种植所用种苗并非通过生物技 术方法获得，而是直接播撒种子获得幼苗。目前尚未见到通过无性繁殖进行滇紫草植株再 生的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种通过愈伤组织进行滇紫草植株再生的方法。该方法的操作步骤如下1)滇紫草胚性愈伤组织的诱导取滇紫草茎尖嫩叶，用蒸馏水把叶表面漂洗干 净，然后置于75%乙醇溶液中浸泡20s，迅速去除乙醇溶液，用灭菌蒸馏水漂洗叶片2次，随 后转移到2%的次氯酸钠溶液中浸泡2min，取出叶片，用灭菌蒸馏水漂洗3次。把经过消毒 的叶片放到已灭菌的培养皿中，用刀片切割成大小约0. 5cm2的小块，并移至愈伤组织诱导 培养基上诱导愈伤组织。诱导培养基和培养条件为MS基础培养基+NAA 0. 1-0. 3mg/L+2, 4-D 0. 8-1. 5mg/L,固体琼脂培养，pH值5. 6，温度25°C，避光培养；2)胚性愈伤组织的继代步骤1)中诱导出的愈伤组织为胚性愈伤组织，该愈伤组 织需要继代2次以后才用于器官分化获得植株。继代培养基和培养条件为MS基础培养基 +KT L0mg/L+2，4-D 0. 2mg/L，固体琼脂培养，pH值5. 6，温度25°C，避光培养。3)胚性愈伤组织丛生芽的分化从继代培养基中取出胚性愈伤组织接种到分化 培养基中，既可分化出丛生芽。丛生芽分化培养基和培养条件为无蔗糖MS基础培养基 +KTl. 0-2. Omg/L+蔗糖30_50g/L，固体琼脂培养，pH值5. 6，温度25°C，避光培养。4)丛生芽的扶壮和根的诱导发生待步骤3)中的丛生芽长至Icm左右，将其从基部切下，进行丛生芽的扶壮培养。丛生芽扶壮培养基和培养条件为无蔗糖MS基础培养基+KT 2. 0mg/L+蔗糖30g/L,固体琼脂培养，pH值5. 6，温度25°C，光照培养，光强5000Lux ； 5)经过扶壮的丛生芽长至4cm左右的无根苗时，将苗移至生根培养基中诱导生 根，生根培养基和培养条件为无蔗糖MS基础培养基+IBA 1. 0-2. 0mg/L+蔗糖10_20g/L， 固体琼脂培养，pH值5. 6，温度25°C，光照培养，光强5000LUX ； 6)炼苗和移栽待步骤4)中的幼苗长出4条以上的根，且长度超过1. 5cm,即可进 行炼苗，炼苗过程将组培瓶移至温室，瓶盖揭开2-3天，然后将幼苗从瓶中取出，用自来水 将粘附于根上的琼脂清洗干净(切勿弄断幼根)，移至以蛭石和珍珠岩混合物为基质的培 养穴中炼苗10天左右，移栽过程经过炼苗的幼苗长出两片新叶后可移至自然土壤环境中 进行生长，整个植株再生过程结束。本专利技术能够获得高繁殖系数的胚性愈伤组织，获得的滇紫草再生植株成活率高， 生长状态良好，可应用到大规模培育滇紫草人工植株的实际生产过程中。具体实施例方式以下实施例用于说明本专利技术，但不是对本专利技术的限制。实施例1 1)取滇紫草茎尖嫩叶，用蒸馏水把叶表面漂洗干净，然后置于75%乙醇溶液中浸 泡20s，迅速去除乙醇溶液，用灭菌蒸馏水漂洗叶片2次，随后转移到2%的次氯酸钠溶液中 浸泡2min，取出叶片，用灭菌蒸馏水漂洗3次。把经过消毒的叶片放到已灭菌的培养皿中， 用刀片切割成大小约0. 5cm2的小块，并移至愈伤组织诱导培养基上诱导愈伤组织。诱导培 养基和培养条件为MS基础培养基+NAA0. 3mg/L+2，4-D 0. 8mg/L,固体琼脂培养，pH值5. 6， 温度25°C，避光培养30天后获得胚性愈伤组织。2)诱导出的胚性愈伤组织继代2次以后用于器官分化获得植株。继代培养基和 培养条件为:MS基础培养基+KT 1. Omg/L+2，4-D 0. 2mg/L,固体琼脂培养，pH值5. 6，温度 25 °C，避光培养。3)从继代培养基中取出20块绿豆大小的胚性愈伤组织接种到分化培养基中。培 养两周后，分化出大量丛生芽。丛生芽分化培养基和培养条件为无蔗糖MS基础培养基 +KT1. 0mg/L+蔗糖30g/L，固体琼脂培养，pH值5. 6，温度25°C，避光培养。4)丛生芽长至1cm左右，将其从基部切下，进行丛生芽的扶壮培养。丛生芽扶壮培 养基和培养条件为无蔗糖MS基础培养基+KT 2. 0mg/L+蔗糖30g/L，固体琼脂培养，pH值 5. 6，温度25°C，光照培养，光强5000LUX。5)经过扶壮的丛生芽长至4cm左右的无根苗时，将苗移至生根培养基中诱导生 根。生根培养基和培养条件为无蔗糖MS基础培养基+IBA 1. 0mg/L+蔗糖10g/L，固体琼 脂培养，pH值5. 6，温度25°C，光照培养，光强5000LUX。6)幼苗长出4条以上的根，且长度超过1. 5cm,即可进行炼苗。首先将组培瓶移 至温室，瓶盖揭开2-3天，然后将幼苗从瓶中取出，用自来水将粘附于根上的琼脂清洗干净 (切勿弄断幼根)，移至以蛭石和珍珠岩混合物为基质的培养穴中炼苗10天左右，经过炼苗 的幼苗长出两片新叶后可移至自然土壤环境中进行生长，整个植株再生过程结束，一个月 后统计再生苗成活率。植株再生效率步骤3)中20块胚性愈伤组织共产生丛生芽71个，其中62个经过扶壮和生根处理成为植株，最后移栽成活55棵滇紫草再生苗。实施例2 1)取滇紫草茎尖嫩叶，用蒸馏水把叶表面漂洗干净，然后置于75%乙醇溶液中浸 泡20s，迅速去除乙醇溶液，用灭菌蒸馏水漂洗叶片2次，随后转移到2%的次氯酸钠溶液中 浸泡2min，取出叶片，用灭菌蒸馏水漂洗3次。把经过消毒的叶片放到已灭菌的培养皿中， 用刀片切割成大小约0. 5cm2的小块，并移至愈伤组织诱导培养基上诱导愈伤组织。诱导 培养基和培养条件为MS基础培养基+NAA 0. lmg/L+2，4-D 1. 5mg/L，固体琼脂培养，pH值 5. 6，温度25°C，避光培养30天后获得胚性愈伤组织。2)诱导出的胚性愈伤组织继代2次以后用于器官分化获得植株。继代培养基和 培养条件为=MS基础培养基+KT 1. Omg/L+2，4-D 0. 2mg/L,固体琼脂培养，pH值5. 6，温度 25 °本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种通过愈伤组织再生滇紫草植株的方法，其特征在于该方法的操作步骤包括：１）滇紫草胚性愈伤组织的诱导：把经过消毒的滇紫草叶片移至愈伤组织诱导培养基上，诱导培养基和培养条件为：ＭＳ基础培养基＋ＮＡＡ　０．１－０．３ｍｇ／Ｌ＋２，４－Ｄ　０．８－１．５ｍｇ／Ｌ，固体琼脂培养，ｐＨ值５．６，温度２５℃，避光培养；２）胚性愈伤组织的继代：步骤１）中诱导出的胚性愈伤组织，进行继代２次，继代培养基和培养条件为：ＭＳ基础培养基＋ＫＴ　１．０ｍｇ／Ｌ＋２，４－Ｄ　０．２ｍｇ／Ｌ，固体琼脂培养，ｐＨ值５．６，温度２５℃，避光培养；３）胚性愈伤组织丛生芽的分化：从继代培养基中取出胚性愈伤组织接种到分化培养基中，既可分化出丛生芽，丛生芽分化培养基和培养条件为：无蔗糖ＭＳ基础培养基＋ＫＴ１．０－２．０ｍｇ／Ｌ＋蔗糖３０－５０ｇ／Ｌ，固体琼脂培养，ｐＨ值５．６，温度２５℃，避光培养；４）丛生芽的扶壮和根的诱导发生：待步骤３）中的丛生芽长至１ｃｍ左右，将其从基部切下，进行丛生芽的扶壮培养，丛生芽扶壮培养基和培养条件为：无蔗糖ＭＳ基础培养基＋ＫＴ　２．０ｍｇ／Ｌ＋蔗糖３０ｇ／Ｌ，固体琼脂培养，ｐＨ值５．６，温度２５℃，光照培养，光强５０００Ｌｕｘ；５）经过扶壮的丛生芽长至４ｃｍ左右的无根苗时，将苗移至生根培养基中诱导生根，生根培养基和培养条件为：无蔗糖ＭＳ基础培养基＋ＩＢＡ　１．０－２．０ｍｇ／Ｌ＋蔗糖１０－２０ｇ／Ｌ，固体琼脂培养，ｐＨ值５．６，温度２５℃，光照培养，光强５０００Ｌｕｘ；６）炼苗和移栽：待步骤４）中的幼苗长出４条以上的根，且长度超过１．５ｃｍ，可进行炼苗，移至以蛭石和珍珠岩混合物为基质的培养穴中炼苗１０天，待幼苗长出两片新叶后可进行移栽。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：葛锋，黄文虎，刘迪秋，陈朝银，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：53[中国|云南]