全基因合成鸡α干扰素基因及蛋白表达制造技术

本发明专利技术涉及利用全基因合成技术获得鸡α干扰素基因及进行干扰素蛋白的原核表达，属于生物制药领域。包括对鸡α干扰素基因序列进行密码子的改造并全基因合成此序列，含鸡α干扰素基因的原核表达载体的构建，用所述含鸡α干扰素基因的原核表达载体转化大肠杆菌及诱导表达，蛋白提取及变性复性，及抗病毒活性的研究。试验所得干扰素能抵抗水疱性口炎病毒的攻击，比活性达到１．０６×１０５Ｕ／ｍｇ。该方法生产干扰素工艺简单，表达量高，生物活性高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程生物制药领域，涉及利用全基因合成技术获得鸡α干扰素 基因及其干扰素蛋白的原核表达。二
技术介绍
目前，随着我国养鸡规模的不断扩大和集约化程度的不断提高，新城疫、禽流感、 鸡传染性支气管炎等鸡病毒性疾病所带来的危害越来越严重，给养鸡业造成重大的损失。 干扰素系统是机体对抗病毒感染的重要防御系统，当干扰素系统被激活后，血清干扰素可 以在几分钟之内扩散到身体各器官，而细胞接触干扰素只需几分钟就可产生抗病毒状态， 而且，动物可以在一到三周内对其他病毒的重复感染有抵抗作用。根据干扰素的氨基酸序 列、抗原性和细胞来源的不同可将其分为2个型1型干扰素的主要成员为α干扰素和β 干扰素，II型干扰素为Y干扰素.而其中α干扰素(IFN-α)以其突出的抗病毒作用而 备受人们重视。由诱生剂诱导产生的天然鸡IFN-α，因来源少、成本高、纯化工艺复杂等诸多原因 而价格昂贵，极大的限制了临床和科研的应用，而利用基因工程技术选择一个合适的系统， 使其得到高效表达，生产具有廉价、广谱抗病毒活性、无毒害、无残留等优点的干扰素已经 无疑是促使干扰素在兽医临床上推广应用的有效途径。三
技术实现思路
技术问题本专利技术的目的之一在于对鸡α干扰素基因序列进行密码子改造后，通过全基因 合成技术合成此序列并构建高效表达载体，实现干扰素在大肠杆菌的高表达，获得具有抗 病毒活性的鸡α干扰素蛋白。本专利技术的另一目的是提供一种通过全基因合成技术合成的经过改造的核酸，其特 征在于所述核酸包含编码鸡α干扰素的阅读框，并且在该阅读框内全部采用大肠杆菌偏 爱的密码子。优选的，上述阅读框的碱基序列如SEQ ID NO. 1所示。本专利技术的另一目的是提供一种含有上述核酸的重组载体。本专利技术的另一目的是提供一种含有上述重组载体的大肠杆菌。本专利技术还提供一种在原核表达系统中提高鸡α干扰素表达量的方法，其包含如 下步骤(1)在不改变鸡α干扰素氨基酸序列的基础上设计其编码核酸序列，使阅读框内 的每个密码子都采用大肠杆菌偏爱的密码子；(2)人工合成步骤(1)中设计的编码核酸； (3)将步骤(2)合成的核酸插入适当的表达载体，构建重组表达载体；(4)将步骤(3)构建 的重组表达载体转化适当的大肠杆菌进行诱导表达。技术方案本专利技术的技术方案如下3(一)鸡α干扰素基因的合成(1)登录GeneBank，查找编码鸡α干扰素成熟蛋白的基因序列；(2)利用SignalP 3. OServer软件预测此基因序列有无信号肽及其位置；(3)利用TargetP 1. IServer软件检测此信号肽的功能；(4)将鸡α干扰素的编码密码子与大肠杆菌偏好密码子进行比对，根据密码子的 兼并性，将鸡α干扰素密码子替换为大肠杆菌偏好的密码子；(5)将替换后的序列5'、3'端分别加上EcoRI、XhoI酶切位点，送生物公司进行 全基因合成；(二)鸡α干扰素的原核表达(1)重组质粒 pET32a-ChIFN_ α 转化大肠杆菌 BL21 (DE3)；(2)阳性重组菌诱导表达，最佳诱导时间的确定及表达蛋白可溶性鉴定；(3)重组阳性菌稳定性检测；(三)重组鸡α干扰素的提取(1)菌体破碎；(2)包涵体洗涤；(3)包涵体变性；(4)目的蛋白透析复性及蛋白浓度测定；(四)重组鸡α干扰素抗病毒活性测定利用微量病变抑制法测定干扰素活性(1)制备鸡胚成纤维细胞；(2)接种96孔细胞板；(3)滤泡性口炎病毒(VSV)对鸡胚成纤维细胞半数致死量的测定；(4)干扰素抗VSV活性测定，将抑制50%细胞病变的干扰素的最高稀释度定为1 个干扰素单位。四附图说明图1是重组鸡α干扰素蛋白表达SDS-PAGE电泳图泳道1 诱导表达前；泳道2-6 诱导表达1，2，3，4，5小时；泳道7 蛋白质分子量 标准(Marker)。重组菌经诱导表达后在分子量32kD处有增加的蛋白表达条带，与预期的蛋 白分子量一致(干扰素分子量17. 8kD，加上载体本身的融合标签14. 3kD)，且在5小时时表 达量最高，所以选用的最佳诱导时间为5小时。图2是重组鸡α干扰素蛋白可溶性鉴定图泳道1 菌体破碎后上清；泳道2 菌体破碎后沉淀；泳道3 蛋白质分子量标准 (Marker)。电泳结果显示目的蛋白为包涵体形式表达。图3是目的蛋白纯化效果SDS-PAGE电泳图泳道1 蛋白质分子量标准(Marker)；泳道2 纯化后的目的蛋白。五具体实施例方式下面结合实施例及附图对本专利技术进行进一步的描述。实施例1鸡α干扰素基因的合成登录GeneBank，查找编码鸡α干扰素成熟蛋白的基因序列(序列号为 EU937528)，利用SignalP 3. OServer软件预测此基因可能含有一段信号肽序列，为其氨基 酸序列的前30个氨基酸，利用TargetP 1. IServer软件检测此序列功能，发现其为帮助蛋 白分泌的信号肽而非蛋白结构所必需，由于鸡α干扰素为真核生物干扰素，但后续研究需 要在原核生物中进行表达，真核生物的信号肽在原核生物细胞环境中由于缺少相应的受体 而不能发挥作用，所以我们去掉信号肽序列，剩下编码成熟鸭鸡α干扰素的基因序列，其 核苷酸长度为489bp ；将鸡α干扰素的编码密码子与大肠杆菌偏好密码子进行比对，根据 密码子的兼并性，在不改变氨基酸组成和排列顺序的基础上，对已知的编码鸡α干扰素的 基因序列进行改造，替换为大肠杆菌喜好的密码子，旨在提高基因在大肠杆菌的表达水平；然后将替换后的序列5'、3'端分别加上EcoRI、XhoI酶切位点，送上海英 骏生物公司进行全基因合成，并连入原核表达质粒pET32a中，得到重组原核表达质粒 pET32a-ChIFN_α ；实施例2鸡α干扰素蛋白的原核表达1将测序正确的重组质粒pET32a-ChIFN_ α转入BL21 (DE3)，挑取单菌落进行双酶 切鉴定；2阳性重组菌的诱导表达挑取含有重组阳性质粒的单菌落，接种到含有浓度为lOOmg/mL氨苄青霉素的LB 液体培养基中，37°C振荡培养过夜。按的比例将过夜培养的菌液接种于Amp+/LB液体 培养基中，培养3h至菌液光密度值达0. 4-0. 6，立即加入IPTG至工作浓度达ImM，继续培养 5h，每Ih取Iml菌液，进行SDS-PAGE电泳，以确定最佳诱导时间(见附图1)；3大肠杆菌表达的鸡α干扰素的可溶性鉴定取经IPTG诱导的菌液，40C，12000rpm,离心IOmin后收集菌体，弃上清，沉淀经PBS 洗涤三次后超声波破碎，超声条件为功率400w，工作5秒，间隔10秒反复80次。离心，分别 取上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳，以鉴定目的蛋白的可溶性(见附图2)；4重组阳性菌稳定性检测挑取含有重组阳性质粒的单菌落接种于LB液体培养基中，37°C振荡培养，每12小 时以转接一次，传代过程中均不添加氨苄青霉素，连续传代25次，然后取每一代培养的 菌液进行IPTG诱导表达，进行SDS-PAGE电泳观察表达情况；实施例3重组鸡α干扰素的提取1菌体破碎离心收集诱导后的菌体，PBS洗涤三次，超声破碎细胞，涂片镜检，观察破碎效果， 弃上清，得到粗制的包涵体；2包涵体的洗涤用含2Μ脲的包涵体洗涤液充分洗涤包涵体，40C，12000rpm,离心15min，弃上清；3包涵体的变性用含8M脲的包涵体本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种通过全基因合成技术合成的经过改造的核酸，其特征在于：所述核酸包含编码鸡α干扰素的阅读框，并且在该阅读框内全部采用大肠杆菌偏爱的密码子。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：姚火春，张炜，潘子豪，胡伟娟，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]