一种水蛭素或水蛭素类似物环肽的冻干粉及制备方法技术

本发明专利技术属于多肽冻干制剂技术领域，具体提供了一种水蛭素或水蛭素类似物环肽的冻干粉及制备方法。本发明专利技术使用氧化型谷胱甘肽与还原型谷胱甘肽作为复配稳定剂，利用其氧化还原特性，减少外界环境对水蛭素或水蛭素类似物环肽中二硫键、磺酸化衍生的酪氨酸的破坏，改善冻干粉外观，解决水蛭素样品在存放中，尤其是暴露在光照、高温等条件下的发黄、浑浊的问题。同时该冻干粉成分明确，安全性高，不影响水蛭素或水蛭素类似物环肽在医疗、美容等领域的应用。用。

【技术实现步骤摘要】
一种水蛭素或水蛭素类似物环肽的冻干粉及制备方法


[0001]本专利技术属于多肽冻干制剂
，具体涉及一种水蛭素或水蛭素类似物环肽的冻干粉及制备方法。

技术介绍

[0002]水蛭素(英文名Hirudin)是一种单链环肽化合物，是目前已知特异性最强的凝血酶抑制剂。天然水蛭素包括10种结构变异体，其中研究和应用较为广泛的为HV1、HV2和HV3三种变异体，其肽链由65
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66个氨基酸残基组成，相对分子量7000左右，结构中存在三个二硫键，分别由6
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14位、16
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28位以及22
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39位的半胱氨酸残基连接而成。水蛭素可通过从水蛭的唾液腺中提取获得或采用重组技术获得，水蛭素的3个二硫键是维持其二级和三级结构稳定性的关键，当二硫键遭到破坏，水蛭素将失去抗凝作用。此外，当C
‑
端的羧基被酯化或是失去了C
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端氨基酸，水蛭素也会失去抗凝作用。天然水蛭素的碳端有一个磺酸化衍生的酪氨酸，对活性有显著影响，重组水蛭素失去了在此位置的磺酸化衍生，活性比天然水蛭素差。
[0003]目前上市或研发中的水蛭素多肽类似物有多种，其中比伐卢定(Bivalirudin)是不含二硫键的线性短肽；CX
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397R是一种末端氨基酸置换的水蛭素环肽类似物，二硫键数量及位置与水蛭素相同(Komatsu Y,Inoue Y,Goto Y,et al.Pharmacological Effects of a Novel Recombinant Hirudin,CX
‑
397,In Vivo and In Vitro:Comparison with Recombinant Hirudin Variant
‑
1,Heparin,and Argatroban[J].Thrombosis&Haemostasis,1999,81(2):250
‑
255)。
[0004]水蛭素结构的三对二硫键与还原性剂共存时可能打开二硫键，二硫键还原所产生的游离巯基导致热稳定性、pH稳定性和效价降低，且使蛋白聚集体增多，尤其是对高温和光照条件敏感。同时，水蛭素结构中磺酸化衍生的酪氨酸可被氧化。目前研发中或申报中的水蛭素制剂多为注射液或冻干粉。其中冻干粉对于保持热敏感物质的稳定性较为有利。但技术人员发现即使制剂中加入冻干保护剂等非特异性保护剂辅料，水蛭素溶液或冻干粉在长期放置时仍可发生变黄现象，伴有结块或浑浊，影响水蛭素产品的正常使用。导致此类现象的原因，与水蛭素化学结构中的上述不稳定性结构可能有关。
[0005]为抑制二硫键还原，提高二硫键的正确配对，在多肽化学合成
通常采用加入双氧水、碘、高锰酸钾等氧化剂。但在多肽制剂
，加入上述物质将导致制剂中引入毒性或刺激性成分，限制其临床应用，尤其是在皮肤外用制剂领域或注射制剂领域的使用。
[0006]对于类似的多肽制剂稳定性问题，通常在制剂中单独加入氧化剂或还原剂对易被还原或易被氧化的基团进行保护，如使用二硫赤藓糖醇、二硫苏糖醇、抗坏血酸、烯醇式己糖酸内酯等抗氧化剂保护游离巯基等免受氧化破坏或形成二硫键(例如CN105037485A)、使用氧化剂等保护二硫键免受还原破坏(例如环肽合成中常用的氧化剂)。但水蛭素结构具有其特殊性，其既存在易被还原破坏的结构(如二硫键)，也存在易被氧化破坏的结构(如磺酸
化衍生的酪氨酸)，导致其稳定性较好的制剂研发难度较大。目前多数水蛭素制剂仍依赖传统的非特异性保护剂，如糖类或氨基酸类冻干保护剂维持制剂具备一定的稳定性。
[0007]谷胱甘肽是人体内存在的小分子3肽，存在于几乎身体的每个细胞，广泛参与生命过程的氧化还原反应，谷胱甘肽可维持正常的免疫系统功能，并具有抗氧化、整合解毒作用。谷胱甘肽不仅可作为药物，更可作为功能性食品，在延缓衰老、增强免疫力、抗肿瘤等功能性食品广泛应用。谷胱甘肽有还原型(GSH)和氧化型(GSSG)两种形式，生理条件下以还原型谷胱甘肽占绝大多数，谷胱甘肽还原酶可以催化两型间的互变。多肽合成中谷胱甘肽可用于富含多个巯基的活性蛋白多肽的二硫键构建。还原型和氧化型谷胱甘肽均具有良好的安全性。

技术实现思路
：
[0008]针对水蛭素制剂存在的上述稳定性问题，本专利技术首先是提供一种水蛭素或水蛭素类似物环肽的冻干粉，以提高水蛭素冻干粉的稳定性，包括复溶后的稳定性。
[0009]为实现上述目的，采用的方案如下：
[0010]一种水蛭素或水蛭素类似物环肽的冻干粉，至少含有水蛭素或水蛭素类似物环肽、冻干保护剂。其中水蛭素可以是提取自水蛭唾液的提取所得环肽，也可以是采用基因重组技术利用细胞株发酵制备的所得环肽；其中水蛭素类似物环肽含有1～3个二硫键，且碳端含有磺酸化衍生的酪氨酸。其中冻干保护剂选自糖、多羟基化合物、氨基酸、聚合物、无机盐中至少一种。通常认为冻干保护剂的保护原理与水替代或玻璃态有关。该冻干粉还含有氧化型谷胱甘肽和还原型谷胱甘肽，就氧化型谷胱甘肽和还原型谷胱甘肽的用量配比而言，所述冻干粉制备时氧化型谷胱甘肽与还原型谷胱甘肽用量的摩尔比大于1:1；就氧化型谷胱甘肽与活性成分的用量配比而言，所述冻干粉制备时水蛭素或水蛭素类似物环肽与氧化型谷胱甘肽用量的摩尔比为10:1～1000:1。
[0011]优选地，水蛭素或水蛭素类似物环肽，所述冻干保护剂选自海藻糖、甘露醇、甘氨酸、右旋糖酐、精氨酸、牛血清白蛋白中的至少一种。进一步优选地，所述冻干保护剂选自甘露醇、海藻糖醇中的至少一种。
[0012]优选地，对于水蛭素或水蛭素类似物环肽，所述冻干粉制备时氧化型谷胱甘肽和还原型谷胱甘肽用量的摩尔比为3:1～10:1。进一步优选地，所述冻干粉制备时氧化型谷胱甘肽和还原型谷胱甘肽用量的摩尔比为6:1；所述冻干粉制备时水蛭素或水蛭素类似物环肽与氧化型谷胱甘肽用量的摩尔比为100:1。
[0013]本专利技术还提供了上述冻干粉的一种制备方法，包括如下步骤:
[0014]S1:取水蛭素或水蛭素类似物环肽，加水溶解，制备环肽水溶液；
[0015]S2:分别将氧化型谷胱甘肽和还原型谷胱甘肽用水溶解，混合所得溶液制备谷胱甘肽混合液；
[0016]S3:将环肽水溶液和谷胱甘肽混合液混合，加入冻干保护剂混匀，调pH为7.5
±
0.5，制备冻干溶液；
[0017]S4:冻干溶液置于冻干机，设置冻干程序，制备冻干粉。
[0018]其中，步骤S3优选地采用氢氧化钠调节pH。
[0019]其中，步骤步骤S4的冻干步骤优选的冻干程序如下:
[0020]时间初始板层温度板层温度真空度0min～65min25℃
‑
40℃1.01x10
5 pa65min～4h
‑
40℃
‑
40℃1.01x10
5 pa4h～6h
‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种水蛭素或水蛭素类似物环肽的冻干粉，含有水蛭素或水蛭素类似物环肽、冻干保护剂；其特征在于，所述冻干粉还含有氧化型谷胱甘肽和还原型谷胱甘肽，所述冻干粉制备时氧化型谷胱甘肽与还原型谷胱甘肽用量的摩尔比大于1:1；所述冻干粉制备时水蛭素或水蛭素类似物环肽与氧化型谷胱甘肽用量的摩尔比为10:1～1000:1；所述水蛭素类似物环肽含有1～3个二硫键。2.根据权利要求1所述的冻干粉，其特征在于，所述冻干保护剂选自海藻糖、甘露醇、甘氨酸、右旋糖酐、精氨酸、牛血清白蛋白中的至少一种。3.根据权利要求2所述的冻干粉，其特征在于，所述冻干保护剂选自甘露醇、海藻糖醇中的至少一种。4.根据权利要求1或2所述的冻干粉，其特征在于，所述冻干粉制备时氧化型谷胱甘肽和还原型谷胱甘肽用量的摩尔比为3:1～10:1。5.根据权利要求4所述的冻干粉，其特征在于，所述冻干粉制备时氧化型谷胱甘肽和还原型谷胱甘肽用量的摩尔比为6:1；所述冻干粉制备时水蛭素或水蛭素类似物环肽与氧化型谷胱甘肽用量的摩尔比为100:1。6.权利要求4所述冻干粉的制备方法，其特征在于，所述冻干粉的制备方法包括如下步骤:S1:取水蛭素或水蛭素类似物环肽，加水溶解，制备环肽水溶液；S2:分别将氧化型谷胱甘肽和还原型谷胱甘肽用水溶解，混合所得溶液制备谷胱甘肽混合液；S3:将环肽水溶液和谷胱甘肽混合液混合，加入冻干保护剂混匀，调pH为7.5

【专利技术属性】
技术研发人员：晏卫祥，陈明鲁，
申请(专利权)人：广州森升生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：