一种转基因不育鸡的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种转基因不育鸡的制备方法，属于基因工程领域。上述方法包括以下步骤：(1)使用CRISPR/cas9介导的同源重组修复将HSV

【技术实现步骤摘要】
一种转基因不育鸡的制备方法


[0001]本专利技术涉及基因工程领域，特别是涉及一种转基因不育鸡的制备方法。

技术介绍

[0002]提高原始生殖细胞(Primordial germcells，PGCs)的细胞移植生殖系遗传效率的策略主要分为两种，其中一个策略是改进和优化PGCs的细胞培养体系，使得细胞在体外培养和基因操作之后仍然能否保持完整的生殖细胞特性，提高生成配子的能力，该方面的尝试包括缩短体外培养时间、添加促进生长和维持生殖细胞特性的物质等，但是效果不稳定，或者操作难度大，此外，该方式使得宿主胚胎的性腺同时包含引入的供体PGCS和内源性宿主PGCS，减少了随后交配的后代来自供体PGCS的机会，即生殖系遗传效率低。另外的一种策略是消除受体鸡胚内源的生殖细胞，提高性腺中移植的外源生殖细胞的比例，该方法包括利用物理辐射或者利用基因修饰定向消除内源生殖细胞。虽然通过以上方式，这些遗传上不育的受体宿主被证明能够有效地从移植的外源生殖细胞产生后代，但是均存在一些缺陷和不足。比如：单独的物理辐射方式，对发育中的受体宿主胚胎和成熟的宿主动物可能存在高度毒性；而通过消除生殖细胞发育所需基因进而消融内源性生殖细胞的手段，仅能制备雌性的不育鸡胚，不能用雄性PGCs移植。因此，急需进一步的优化和研究基于生殖细胞提高转基因生殖细胞嵌合体的效率的方法。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的是制备一种转基因不育鸡模型，以解决上述现有技术存在的问题，通过外源转入HSV
‑
TK基因构建转基因鸡，并且在更昔洛韦辅助下特异消除鸡胚中的生殖细胞，进而可作为原始生殖细胞移植的受体鸡胚，进而实现提高移植外源原始生殖细胞的生殖系遗传效率。
[0004]为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：
[0005]本专利技术提供一种转基因不育鸡胚的制备方法，包括以下步骤：
[0006](1)使用CRISPR/cas9介导的同源重组修复将HSV
‑
TK基因定点插入到鸡原始生殖细胞特异性表达DAZL基因最后一个编码外显子的3
’
端，使得所述原始生殖细胞特异表达所述HSV
‑
TK基因，回注受体鸡胚中，制备HSV
‑
TK嵌合体鸡；
[0007](2)经HSV
‑
TK嵌合体鸡配种之后得到HSV
‑
TK转基因受体鸡胚，给予更昔洛韦消除内源生殖细胞，从而获得转基因不育鸡胚。
[0008]优选的是，(1)中，将HSV
‑
TK基因定点插入到鸡原始生殖细胞，具体包括以下步骤：
[0009]将Cas9、sgRNA质粒和供体质粒转染至原始生殖细胞，转染1周后，筛选阳性的原始生殖细胞，再接种于MKO培养基中进行扩增培养并建系，得到鸡原始生殖细胞的细胞系；其中，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述供体质粒是将外源基因HSV
‑
TK转入表达载体构建而成，所述HSV
‑
TK基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
[0010]SgRNA(SEQ ID NO：1)：agggcgcatcacttcagaaaagg。
[0011]HSV基因(SEQ ID NO：2)：
[0012]ATGGCCTCGTACCCCGGCCATCAACACGCGTCTGCGTTCGACCAGGCTGCGCGTTCTCGCGGCCATAG
[0013]CAACCGACGTACGGCGTTGCGCCCTCGCCGGCAGCAAGAAGCCACGGAAGTCCGCCCGGAGCAGAA
[0014]AATGCCCACGCTACTGCGGGTTTATATAGACGGTCCCCACGGGATGGGGAAAACCACCACCACGCAA
[0015]CTGCTGGTGGCCCTGGGTTCGCGCGACGATATCGTCTACGTACCCGAGCCGATGACTTACTGGCGGGT
[0016]GCTGGGGGCTTCCGAGACAATCGCGAACATCTACACCACACAACACCGCCTCGACCAGGGTGAGATA
[0017]TCGGCCGGGGACGCGGCGGTGGTAATGACAAGCGCCCAGATAACAATGGGCATGCCTTATGCCGTGA
[0018]CCGACGCCGTTCTGGCTCCTCATATCGGGGGGGAGGCTGGGAGCTCACATGCCCCGCCCCCGGCCCT
[0019]CACCCTCATCTTCGACCGCCATCCCATCGCCGCCCTCCTGTGCTACCCGGCCGCGCGGTACCTTATGGG
[0020]CAGCATGACCCCCCAGGCCGTGCTGGCGTTCGTGGCCCTCATCCCGCCGACCTTGCCCGGCACCAAC
[0021]ATCGTGCTTGGGGCCCTTCCGGAGGACAGACACATCGACCGCCTGGCCAAACGCCAGCGCCCCGGCG
[0022]AGCGGCTGGACCTGGCTATGCTGGCTGCGATTCGCCGCGTTTACGGGCTACTTGCCAATACGGTGCGG
[0023]TATCTGCAGTGCGGCGGGTCGTGGCGGGAGGACTGGGGACAGCTTTCGGGGACGGCCGTGCCGCCC
[0024]CAGGGTGCCGAGCCCCAGAGCAACGCGGGCCCACGACCCCATATCGGGGACACGTTATTTACCCTGT
[0025]TTCGGGCCCCCGAGTTGCTGGCCCCCAACGGCGACCTGTATAACGTGTTTGCCTGGGCCTTGGACGTC
[0026]TTGGCCAAACGCCTCCGTTCCATGCACGTCTTTATCCTGGATTACGACCAATCGCCCGCCGGCTGCCG
[0027]GGACGCCCTGCTGCAACTTACCTCCGGGATGGTCCAGACCCACGTCACCACCCCCGGCTCCATACCGACGATATGCGACCTGGCGCGCACGTTTGCCCGGGAGATGGGGAGGCTAAC。
[0028]优选的是，将阳性的原始生殖细胞注射到15期鸡胚，孵化获得F0嵌合体，性成熟后通过测交获得F1代转基因不育鸡。
[0029]优选的是，所述原始生殖细胞的制备方法，包括以下步骤：
[0030]S1：制备饲养层：将MEF1代细胞经洗涤、胰酶消化后，按照MEF1代细胞和饲养层的细胞培养液的体积比为1:3传代培养，传至饲养层第三代时，用丝裂霉素处理，弃去培养液，清洗细胞后，换新的所述细胞培养液，制得饲养层；
[0031]S2：受精后的鸡蛋恒温孵化，再获取孵化后的鸡蛋的性腺，将所述性腺经洗涤、胰蛋白酶消化后本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种转基因不育鸡胚的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)使用CRISPR/cas9介导的同源重组修复将HSV
‑
TK基因定点插入到鸡原始生殖细胞特异性表达DAZL基因最后一个编码外显子的3
’
端，使得所述原始生殖细胞特异表达所述HSV
‑
TK基因，回注受体鸡胚中，制备HSV
‑
TK嵌合体鸡；(2)经HSV
‑
TK嵌合体鸡配种之后得到HSV
‑
TK转基因受体鸡胚，给予更昔洛韦消除内源生殖细胞，从而获得转基因不育鸡胚。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，(1)中，将HSV
‑
TK基因定点插入到鸡原始生殖细胞，具体包括以下步骤：将Cas9、sgRNA质粒和供体质粒转染至原始生殖细胞，转染3d后，筛选阳性的原始生殖细胞，再接种于MKO培养基中进行扩增培养并建系，得到鸡原始生殖细胞的细胞系；其中，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述供体质粒是将外源基因HSV
‑
TK转入表达载体构建而成，所述HSV
‑
TK基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，将阳性的原始生殖细胞注射到15期鸡胚，孵化获得F0嵌合体，性成熟后通过测交获得F1代转基因不育鸡。4.如权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：陆阳清，覃海媚，黄振文，贾肖轩，支怡飞，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：