用于EBER原位杂交检测的探针组合物，试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了用于EBER原位杂交检测的探针组合物、试剂盒及其应用，所述探针组合物包括核苷酸序列如SEQ ID No.1的第一探针和核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的第二探针，所述第一探针和第二探针的3

【技术实现步骤摘要】
用于EBER原位杂交检测的探针组合物，试剂盒及其应用


[0001]本专利技术涉及生物检测技术，特别涉及用于EBER原位杂交检测的探针组合物，试剂盒及其应用。

技术介绍

[0002]EB病毒（EBV）是一个172Kbp的双螺旋DNA病毒，属于γ
‑
1型疱疹病毒科嗜淋巴细胞病毒属的成员。EB病毒感染与多种肿瘤和非肿瘤性疾病有关，常见的如鼻咽癌、鼻型NK/T细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、传染性单核细胞增多症以及慢性活动性EBV感染等。
[0003]EBER1和EBER2是EBV转录的2个非编码的小RNA，其长度分别是166和172个核苷酸。其大量存在于EBV潜伏感染的细胞核中（约107个拷贝/细胞），但并不编码蛋白质。据文献报道细胞核内EBER至少能于La(Lupus antigen)蛋白以及EAP(EBV associated protein)蛋白等两种细胞内蛋白质相结合，类似于核糖核蛋白，且存在稳定的二级结构。因此，这种小分子RNA并不像细胞内其他的RNA分子那样容易降解。有研究发现在存档4年的鼻咽癌组织石蜡切片标本中的EBER
‑
1分子也无降解现象，因此为在RNA水平检测EBER提供了可行性。
[0004]目前检测EBV的方法有很多种，如检测EBV表达产物，通过投射电镜观察EB病毒颗粒等，不同的方法其灵敏度也存在差异。核酸原位杂交是一种比较传统的检测方法，但EBV
‑
DNA片段做探针进行原位杂交的话其检测灵敏度并不高，而且由于EBV DNA探针较长（3.1kb）需要更长时间或更高浓度的蛋白酶消化，探针才能进入细胞，所以细胞形态保持不是很好。
[0005]目前市面上常用的EBV检测是通过对EBER进行原位杂交进行检测，其检测步骤主要包括组织切片脱蜡水化、蛋白酶K或胃酶消化、探针孵育、一抗孵育、酶标二抗孵育以及显色等过程。由于目前针对EBER进行的原位杂交检测基本都是针对EBER的mRNA进行的，探针的特异性和灵敏度决定了检测的下限以及原位杂交的时间。同时在EBV的原位杂交检测过程中基本都需要用蛋白酶K或胃酶对样本进行消化，由于酶消化容易使组织细胞的结构和形态遭到破坏，使显微镜下看到的样本组织结构不完整，不利于结果的判读。

技术实现思路

[0006]为了解决
技术介绍
中存在的问题，本专利技术的目的在于提供用于EBER原位杂交检测的探针组合物，试剂盒及应用，提高检测的敏感性和灵敏度。
[0007]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：本专利技术的第一方面提供了用于EBER原位杂交检测的探针组合物，包括核苷酸序列如SEQ ID No.1的第一探针和核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的第二探针；核苷酸序列长度在30nt，具体核苷酸序列分别如下所示：第一探针（5
’‑3’
）：CTCCTCCCTAGCAAAACCCTCAGGACGGCG（SEQ ID No.1）；第二探针（5
’‑3’
）：AATAGCGGACAAGCCGAATACCCTTCTCCC（SEQ ID No.2）；第一探针和第二探针是针对EBER1和EBER2的2条DNA原位杂交探针。所述第一探针
和第二探针分别在3
’
端采用标记物标记。在一些具体实施方案中，用来标记的标记物可以是地高辛、生物素、酶或者纳米材料等。
[0008]本专利技术的第二方面提供了用于EBER原位杂交检测的试剂盒，包括杂交液和原位杂交试剂，所述杂交液包括1：1等量混合的第一方面所述的第一探针和第二探针以及杂交缓冲液。
[0009]进一步地，所述杂交液中第一探针和第二探针的浓度为25ng/ml
‑
200ng/ml。
[0010]进一步地，所述杂交缓冲液的各组分为：体积分数20%的20
×
SSC溶液，体积分数50%的去离子甲酰胺，体积分数2%的50
×
Denhard溶液。
[0011]进一步地，所述原位杂交试剂包括小鼠抗地高辛抗体、阻断剂、聚合物、DAB显色液。
[0012]本专利技术的第三方面提供了一种第一方面所述的用于EBER原位杂交检测的探针组合物在制备用于原位杂交检测产品中的应用。
[0013]本专利技术的第四方面提供了一种石蜡组织切片的EBER原位杂交检测方法，包括如下步骤：S1、切片处理：石蜡切片在烘箱中烤片；在一些具体实施方案中，石蜡切片在62℃烘箱中烤片1小时；S2、脱蜡水化处理：S1处理后的切片放入脱蜡液中处理后用无水乙醇，95%乙醇和75%乙醇梯度酒精进行水化，每个浓度酒精处理2
‑
3次，并用清水清洗干净，后用双氧水室温封闭，清水清洗干净；在一些具体实施方案中，切片放入脱蜡液中，15min
×
2次；采用无水乙醇、95%乙醇和75%乙醇梯度酒精水化，每个浓度酒精2min
×
2次，后用自来水浸洗3min
×
3次；用3%的双氧水室温封闭5min，后用自来水浸洗3min
×
3次；S3、石蜡切片水浴处理：将S2处理后的石蜡切片放入装有pH=8.5，含有柠康酐和二硫苏糖醇的Tris
‑
EDTA缓冲液中并煮沸，维持沸腾状态12
‑
18min后关火自然冷却至室温；S4、探针杂交：S3处理后的石蜡切片平铺在湿盒上，加入包含1:1等量混合的第一方面所述的第一探针和第二探针的杂交液后置于恒温箱中孵育，结束后用PBST浸洗；在一些具体实施方案中，将石蜡切片平铺于湿盒上，滴加杂交液100
µ
L，将湿盒放于50℃恒温箱中孵育90min；S5、抗体孵育：依次添加小鼠抗地高辛抗体、阻断剂、聚合物孵育；每一步孵育完成后用PBST浸洗；在一些具体实施方案中，在每张石蜡切片上滴加100
µ
L的小鼠抗地高辛抗体，室温孵育30min，后用PBST浸洗3min
×
3次；在每张石蜡切片上滴加100
µ
L的阻断剂，室温孵育20min，后用PBST浸洗3min
×
3次；在每张切片上滴加100
µ
L的聚合物，室温孵育30min，后用PBST浸洗3min
×
3次；S6、DAB显色：制备DAB工作液，向样本中加入DAB工作液，至完全覆盖样本，室温孵育染色，染色结束后使用纯化水冲洗样本；在一些具体实施方案中，DAB工作液采用DAB色原试剂与DAB缓冲液按照1：20现配现用，每张切片滴加100
µ
L，室温孵育5min，后用自来水终止并冲洗切片；S7、苏木素复染：使用苏木素进行复染，复染后使用自来水冲洗至无紫色为止，用PBST返蓝；在一些具体实施方案中，苏木素复染7min，后用自来水冲洗至无紫色为止，用PBST返蓝10S；
S8、脱水、透明和封片：用75%，95%和无水乙醇脱水的梯度酒精脱水，每道乙醇的脱水时间30S，脱蜡液透明后用中性树胶滴加在切片上盖上盖玻片。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于EBER原位杂交检测的探针组合物，其特征在于：所述探针组合物包括核苷酸序列如SEQ ID No.1的第一探针和核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的第二探针，所述第一探针和第二探针的3
’
端采用标记物标记。2.用于EBER原位杂交检测的试剂盒，其特征在于：包括杂交液和原位杂交试剂，所述杂交液包括权利要求1所述的探针组合物以及杂交缓冲液，所述探针组合物中第一探针和第二探针按照1：1等量混合。3.根据权利要求2所述的用于EBER原位杂交检测的试剂盒，其特征在于：所述杂交液中第一探针和第二探针的浓度为25ng/ml
‑
200ng/ml。4.根据权利要求3所述的用于EBER原位杂交检测的试剂盒，其特征在于：所述杂交缓冲液的各组分为：体积分数20%的20
×
SSC溶液，体积分数50%的去离子甲酰胺，体积分数2%的50
×
Denhard溶液。5.根据权利要求2所述的用于EBER原位杂交检测的试剂盒，其特征在于：所述原位杂交试剂包括小鼠抗地高辛抗体、阻断剂、聚合物以及DAB显色液。6.权利要求1所述的用于EBER原位杂交检测的探针组合物在制备用于原位杂交检测产品中的应用。7.一种石蜡组织切片的EBER原位杂交检测方法，其特征在于：包括如下步骤：S1、切片处理：石蜡切片在烘箱中烤片；S2、脱蜡水化处理：S1处理后的切片放入脱蜡液中处理后用无水乙醇，95%乙醇和75%乙醇梯度酒精进行水化，每个浓度酒精处理2
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【专利技术属性】
技术研发人员：吴佳，章月凯，蔡宁，陶娜娜，
申请(专利权)人：图凌杭州生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：