一种新型的RNaseH依赖恒温扩增方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种新型的RNase H依赖恒温扩增方法及其应用。该方法在扩增体系中加入RNase H酶或具有RNase H活性的逆转录酶，所采用的引物至少包括一对含有1个或多个核心片段的引物，相邻的两个核心片段由1～30个脱氧核糖核酸碱基段隔开；该核心片段包含至少3个碱基段部分；从5

【技术实现步骤摘要】
一种新型的RNase H依赖恒温扩增方法及其应用


[0001]本专利技术涉及核酸分子检测
，具体涉及一种新型的
RNase H
依赖恒温扩增方法及其应用
。

技术介绍

[0002]近年来，随着分子生物学技术的迅速发展，基于核酸检测的诊断方法已大量建立并广泛应用于疾病的实验室检测中，恒温扩增技术就是在此背景下出现的
。
与其它的核酸扩增技术相比，恒温扩增有快速
、
高效
、
特异的优点且无需专用设备
。
[0003]目前主要的恒温扩增技术有：环介导等温扩增
(LAMP)、
切口内切酶恒温扩增技术
(NEAR)、
依赖核酸序列扩增
(NASBA)、
滚环核酸扩增
(RCA)、
解链酶扩增
(HDA)
和重组酶聚合酶扩增
(RPA)
，这些技术各有特点，这也决定了它们在疾病检测中的应用情况
。
[0004]LMAP
的原理是基于
DNA
在
65℃
左右处于动态平衡状态，任何一个引物向双链
DNA
的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离变成单链，在此前提下利用4种不同的特异性引物识别靶基因的6个特定区域，在链置换型
DNA
聚合酶的作用下，以外侧引物区段的
3'
末端为起点，与模板
DNA
互补序列配对，启动链置换
DNA
合成
。
[0005]LAMP
优势：扩增效率高，反应时间短
。
劣势：引物要求非常高，不容易设计，扩增产物驳杂，非特性扩增多，容易污染，敏感性差
。
[0006]NEAR
是一种链置换放大技术，其原理是在核酸切口内切酶切刻形成的裂口处，通过聚合酶的作用以
dNTPs
为原料从裂口处的
3'
端聚合延伸，置换出等位的
DNA
链，由此又形成了新的完整的含有切刻酶识别位点的
DNA
序列
。
这条双链再次被核酸切口内切酶识别切割，进而开始“聚合
‑
切刻”的循环，产生大量被置换下来的
DNA
单链，形成指数级扩增
。
[0007]NEAR
优势：反应速度快
、
灵敏度高，应用广；缺点：原材料贵
。
[0008]NASBA
是在
PCR
基础上发展起来的一种新技术，是由1对带有
T7
启动子序列的引物引导的连续
、
等温
、
基于酶反应的核酸扩增技术，反应在
41℃
进行，可以在2小时左右将模板
RNA
扩增约
109倍，比常规
PCR
法高
1000
倍，不需特殊的仪器
。
[0009]NASBA
敏感性非常高，相对特异性差，反应体系建立不容易
。
[0010]HDA
是美国
NEB
公司于
2004
年专利技术的一种新型核酸恒温扩增技术
。
该技术模拟体内
DNA
复制的自然过程，利用解旋酶在恒温下解开
DNA
双链，再由
DNA
单链结合蛋白稳定已解开的单链为引物提供模板，然后在
DNA
聚合酶的作用下合成互补的双链，继而不断重复上述循环扩增过程，最终实现靶序列的指数式增长
。
[0011]该技术的敏感性是限制其广泛应用的核心
。
[0012]RPA
是一种新型核酸恒温扩增技术，可以在
37
～
42℃
条件下，
10
～
30min
内实现待测靶标的快速检测
。
在
37
～
42℃
恒温下，该重组酶可与引物
DNA
紧密结合，形成酶和引物的聚合体，当引物在模板
DNA
上搜索到与之完全互补的序列时，在单链
DNA
结合蛋白
(single strande dDNAbinding,SSB)
的帮助下，使模板
DNA
解链，并在
DNA
聚合酶的作用下，形成新的
DNA
互补链
。
往复循环反应产物以指数级增长
。
[0013]RPA
有以下特点：
[0014]1)
速度快：通常5～
10
分钟，既可以完成核酸模板扩增
。
[0015]2)
反应温度低：
37℃
乃至常温即可发生反应
。
[0016]RPA
缺点：
[0017]1)
特异性差：
RPA
引物
28
～
35bp
，很容易产生非特异性扩增
。
[0018]2)
敏感性低：由于非特异性扩增非常多，导致靶点扩增效率低，敏感性差
。
[0019]3)
优化设计难度高：尤其探针法的实时荧光法
RPA
，采用
EXOIII
和
NFO
酶，选择性识别“TNT”序列
。
因此探针为
40
～
55
个碱基，而且需要”TNT”特殊序列，其中
N
为
A
之外的任意碱基，一般选择连续“TTT”结构
。
两端
T
分别标记荧光基团
(F)
和淬灭基团
(Q)
；常见的荧光基团为：
FAM、HEX、VIC、ROX、Cy3、Cy5、NED
等；常见的淬灭基团：
BHQ1、BHQ2、BHQ3
等
。
[0020]由于上述原因，极大限制了
RPA
的临床应用
。
[0021]RNase H
仅特异性降解双链
RNA
：
DNA
杂种中的
RNA
，因此它通常用作分子生物学中的实验室试剂
。RNase H 1
通常用于通过逆转录合成
cDNA
后破坏
RNA
模板，它也可用于在
DNA
的短互补片段存在的情况下，切割特定的
RNA
序列
。RNase H 2
可用于降解冈崎片段的
RNA
引物组分，或在含有核糖核本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种新型的
RNase H
依赖恒温扩增方法，其特征在于，在扩增体系中加入
RNase H
酶或具有
RNase H
活性的逆转录酶，所采用的引物至少包括一对含有1个或多个核心片段的引物，相邻的两个核心片段由1～
30
个脱氧核糖核酸碱基段隔开；所述核心片段包含至少3个碱基段部分；从5’
端起，碱基段1由
10
～
30
个脱氧核糖核苷酸组成，
Tm≥35℃
；碱基段2由1～
10
个核糖核苷酸组成，所述核糖核苷酸的数量优选1～4个；碱基段3由
10
～
30
个脱氧核糖核苷酸组成，与靶序列核酸配对
。2.
根据权利要求1所述的
RNase H
依赖恒温扩增方法，其特征在于，所采用的引物还包括一对链置换引物，其中一条至少与靶基因3’
端的
F3c
区互补，另一条与靶基因5’
端的
B3c
区互补
。3.
根据权利要求1所述的
RNase H
依赖恒温扩增方法，其特征在于，所述
RNase H
依赖恒温扩增方法包括如下步骤：步骤一，提取待测样本的遗传物质；步骤二，设计一对引物，所述引物至少包括一对含有1个或多个核心片段的引物，相邻的两个核心片段由1～
30
个脱氧核糖核酸碱基段隔开；所述核心片段包含至少3个碱基段部分；从5’
端起，碱基段1由
10
～
30
个脱氧核糖核苷酸组成，
Tm≥35℃
；碱基段2由1～
10
个核糖核苷酸组成，所述核糖核苷酸的数量优选1～4个；碱基段3由
10
～
30
个脱氧核糖核苷酸组成，与靶序列核酸配对；步骤三，配制扩增体系，其包括：
Tris
‑
HCl、KCl、(NH4)2SO4、MgSO4、Triton X
‑
100、
待测样本的遗传物质
、dNTP、
引物
、RNase H 2、RNA
抑制剂
、
链置换
DNA
聚合酶和热敏
UDG
；步骤四，恒温扩增
。4.
根据权利要求1所述的
RNase H
依赖恒温扩增方法，其特征在于，所述
RNase H
依赖恒温扩增方法包括如下步骤：步骤一，提取待测样本的遗传物质；步骤二，设计一对引物和一对链置换引物；所述链置换引物中的一条至少与靶基因3’
端的
F3c
区互补，另一条与靶基因5’
端的
B3c
区互补；所述引物至少包括一对含有1个或多个核心片段的引物，相邻的两个核心片段由1～
30
个脱氧核糖核酸碱基段隔开；所述核心片段包含至少3个碱基段部分；从5’
端起，碱基段1由
10
～
30
个脱氧核糖核苷酸组成，
Tm≥35℃
；碱基段2由1～
10
个核糖核苷酸组成，所述核糖核苷酸的数量优选1～4个；碱基段3由
10
～
30
个脱氧核糖核苷酸组成，与靶序列核酸配对；步骤三，配制扩增体系，其包括：
Tris
‑
HCl、KCl、(NH4)2SO4、MgSO4、Triton X
‑
100、
待测样本的遗传物质
、dNTP、
引物
、RNase H 2、RNA
抑制剂
、
链置换
DNA
聚合酶和热敏
UDG
；步骤四，恒温扩增
。5.
根据权利要求4或5所述的
RNase H
依赖恒温扩增方法，其特征在于，所述链置换
DNA
聚合酶选自
Bst DNA
聚合酶
、3137DNA
聚合酶
、Manta DNA
聚合酶
、BsuDNA
聚合酶
、Phi 29DNA
聚合酶
。6.
根据权利要求4或5所述的
RNase H
依赖恒温扩增方法，其特征在于，恒温扩增的条件为
60℃1
分钟，共
40
循环，用于扩增
DNA
；或，
55℃2
分钟；
60℃1
分钟，共
40
循环，用于同时逆转录和扩增
RNA。7.
根据权利要求4或5所述的
RNase H
依赖恒温扩增方法，其特征在于，所述扩增体系还
包括
RTase
，优选还包括荧光探针或荧光染料
。8.
根据权利要求4或5所述的
RNase H
依赖恒温扩增方法，其特征在于，所述扩增体系包括荧光探针，其长度为
15
～
40
碱基，优选为
18
～
30
个碱基；优选地，所述荧光探针包括的核糖核苷酸的数量为1～
10
个，优选为1～4个，所述核糖核苷酸为
rATP、rCTP、rGTP
和
rUTP
中的一种或多种
。9.
根据权利要求8所述的
RNase H
依赖恒温扩增方法，其特征在于，所述荧光探针采用的荧光基团选自以下中的一种或多种：
FAM、HEX、VIC、ROX、Cy3、Cy5、NED
等，采用的淬灭基团选自以下中的一种或多种：
BHQ1、BHQ2、BHQ3
等；荧光基团与淬灭基团之间的碱基数量
n
：
n
＝
1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、
……<...

【专利技术属性】
技术研发人员：齐飞虎，吴菊，朱家龙，
申请(专利权)人：苏州可尔生命科技有限公司，
类型：发明
国别省市：