一种柞蚕幼虫体色性状关联基因发掘方法技术

本发明专利技术属于生物基因工程技术领域，具体公开了一种柞蚕幼虫体色性状关联基因发掘方法，构建柞蚕体色性状分析群体，并统计柞蚕体色性状分析群体的体色性状表型值；基于Super

【技术实现步骤摘要】
一种柞蚕幼虫体色性状关联基因发掘方法


[0001]本专利技术涉及生物基因工程
，特别是一种柞蚕幼虫体色性状关联基因发掘方法
。

技术介绍

[0002]柞蚕
(Antheraea pernyi)
起源于中国，柞蚕业在我国有着
2000
多年历史，我国柞蚕种质资源占世界柞蚕种质资源的
98
％以上
。
柞蚕种质资源是在不同生态条件下经过上千年的自然演变形成的，蕴藏着各种潜在的可利用基因，是国家的宝贵生物资源财富
。
柞蚕种质资源重要性状相关基因的发掘对柞蚕起源和进化
、
培育新品种奠定了丰富的理论基础，也是发展柞蚕科学研究的必经之路
。
因此开展柞蚕种质资源重要性状候选基因发掘对种质资源的鉴定及创新利用研究，及柞蚕分子标记辅助育种技术的开展具有推动作用，对于全世界柞蚕产业发展及柞蚕种质资源的保护具有独特的生物学意义
。
[0003]柞蚕幼虫体色性状在种质资源鉴定中作为首要选择标志，用于评价品种纯度与性状稳定
。
目前对于柞蚕幼虫体色性状的研究主要以发现遗传规律及通过转录组学等手段挖掘相关基因，并没有采用遗传图谱发掘柞蚕幼虫体色性状候选基因的研究
。Super
‑
GBS
技术是在
GBS
基础上衍生出的方法，继承
GBS
技术节省时间
、
成本低，能够在整个基因组发现
SNPr/>标记和基因分型的优点，解决
GBS
测序为了降低成本，权衡标记数和测序深度之间的问题，避免丢失大量数据，造成位点的低序列覆盖率
。
数量性状定位
(Quantitative Trait Locus
，
QTL)
是借助遗传图谱，将分子标记与性状基因锚定在染色体上，分析目标性状与标记之间的连锁关系，并筛选重要性状基因，该方法为准确发现重要性状相关基因提供了有利参考，虽然柞蚕体色性状属于质量性状，但是利用
QTL
分析能够得到相关基因
。
全基因组关联分析
(Genome
‑
WideAssociation Study
，
GWAS)
在动植物的研究中对于重要性状特别是复杂性状相关基因筛选有着快速
、
高效
、
准确的优点，能够弥补
QTL
定位效率低的缺点
。
[0004]因此如果能够基于先进的简化基因组技术，并联合两种分析方法，获得相关基因信息，通过与数据库比对注释，发掘柞蚕幼虫体色性状候选基因，必能够更加有效的
、
准确的对柞蚕种质资源进行评鉴，进一步加深柞蚕品种权的保护研究
。
[0005]因此，亟待开发一种基于
Super
‑
GBS
技术的柞蚕幼虫体色性状关联基因发掘方法
。

技术实现思路

[0006]为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种柞蚕幼虫体色性状关联基因发掘方法
。
[0007]为达到上述目的，本专利技术是按照以下技术方案实施的：
[0008]一种柞蚕幼虫体色性状关联基因发掘方法，包括以下步骤：
[0009]S1、
构建柞蚕体色性状分析群体，并统计柞蚕体色性状分析群体的体色性状表型值；
[0010]S2、
基于
Super
‑
GBS
技术对柞蚕体色性状分析群体的柞蚕材料进行全基因组水平
的
SNP
标记开发与分型，并绘制遗传连锁图谱；
[0011]S3、
利用遗传连锁图谱对体色性状进行
QTL
定位，得到体色性状相应的连锁群物理位置，同时开展体色性状
GWAS
分析，根据两种手段获得关联区域的基因信息，与数据库比对并注释，发掘柞蚕幼虫体色性状候选基因
。
[0012]进一步地，所述步骤
S1
具体包括：
[0013]S11、
以两种不同体色品种的柞蚕作为母本和父本，配置杂交组合，
F1代与母本柞蚕回交得到
BC1M
分析群体；
[0014]S12、
统计柞蚕体色性状分析群体的体色性状表型值：
[0015]统计双亲5龄幼虫成熟期体色，
F1代5龄幼虫成熟期优良区体色
、
羽化蛾期调查性别，
BC1M
代5龄幼虫成熟期体色
、
蛹期调查性别
。
[0016]进一步地，所述步骤
S2
具体包括：
[0017]S21、
柞蚕样品采集及样品
DNA
提取：
[0018]使用动物基因组
DNA
提取试剂盒，对包含
113
个
BC1M
群体的成熟蛹期尾部，3个
F1代个体和两亲本羽化蛾期尾部进行
DNA
提取，提取后对
DNA
的完整性
、
纯度和浓度进行检测，检测完后
‑
80℃
保存备用；
[0019]S22、Super
‑
GBS
文库构建与高通量测序：
[0020]1)
采用
PstI
‑
HF/MspI
对
DNA
进行酶切，酶切后的片段两端用
T4
连接酶加接头和
barcode
；
[0021]2)
使用磁珠回收系统，回收
300
～
700bp DNA
片段，对回收片段进行
PCR
扩增，并测定
PCR
产物浓度；
[0022]3)
将混好的文库上机测序；
[0023]S23、
数据质控：
[0024]使用
Stacks
和
fastp
软件对所得的
Raw Reads
进行质量过滤，过滤标准为：
(1)
去除接头序列；
(2)
去除非
AGCT
碱基大于等于5的
Reads
；
(3)
去除
5'
端和
3'
质量值低于
Q20
的碱基；
(4)
去除长度小于
75bp
的
Reads
；
(5)
去除质量低于
15
的碱基数超过整条
Reads
碱基数
40
％的低质量
Read...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种柞蚕幼虫体色性状关联基因发掘方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、
构建柞蚕体色性状分析群体，并统计柞蚕体色性状分析群体的体色性状表型值；
S2、
基于
Super
‑
GBS
技术对柞蚕体色性状分析群体的柞蚕材料进行全基因组水平的
SNP
标记开发与分型，并绘制遗传连锁图谱；
S3、
利用遗传连锁图谱对体色性状进行
QTL
定位，得到体色性状相应的连锁群物理位置，同时开展体色性状
GWAS
分析，根据两种手段获得关联区域的基因信息，与数据库比对并注释，发掘柞蚕幼虫体色性状候选基因
。2.
根据权利要求1所述的柞蚕幼虫体色性状关联基因发掘方法，其特征在于，所述步骤
S1
具体包括：
S11、
以两种不同体色品种的柞蚕作为母本和父本，配置杂交组合，
F1代与母本柞蚕回交得到
BC1M
分析群体；
S12、
统计柞蚕体色性状分析群体的体色性状表型值：统计双亲5龄幼虫成熟期体色，
F1代5龄幼虫成熟期优良区体色
、
羽化蛾期调查性别，
BC1M
代5龄幼虫成熟期体色
、
蛹期调查性别
。3.
根据权利要求2所述的柞蚕幼虫体色性状关联基因发掘方法，其特征在于，所述步骤
S2
具体包括：
S21、
柞蚕样品采集及样品
DNA
提取：使用动物基因组
DNA
提取试剂盒，对包含
113
个
BC1M
群体的成熟蛹期尾部，3个
F1代个体和两亲本羽化蛾期尾部进行
DNA
提取，提取后对
DNA
的完整性
、
纯度和浓度进行检测，检测完后
‑
80℃
保存备用；
S22、Super
‑
GBS
文库构建与高通量测序：
1)
采用
PstI
‑
HF/MspI
对
DNA
进行酶切，酶切后的片段两端用
T4
连接酶加接头和
barcode
；
2)
使用磁珠回收系统，回收
300
～
700bpDNA
片段，对回收片段进行
PCR
扩增，并测定
PCR
产物浓度；
3)
将混好的文库上机测序；
S23、
数据质控：使用
Stacks
和
fastp
软件对所得的
RawReads
进行质量过滤，过滤标准为：
(1)
去除接头序列；
(2)
去除非
AGCT
碱基大于等于5的
Reads
；
(3)
去除
5'
端和...

【专利技术属性】
技术研发人员：钟亮，姜晓旭，焦阳，谌苗苗，徐亮，赵贺，
申请(专利权)人：辽宁省蚕业科学研究所，
类型：发明
国别省市：