一种Vero细胞适应性登革病毒减毒株及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种Vero细胞适应性登革病毒减毒株及其应用，属于生物技术领域。Vero细胞适应性登革病毒减毒株毒株DV

【技术实现步骤摘要】
一种Vero细胞适应性登革病毒减毒株及其应用


[0001]本专利技术涉及一种Vero细胞适应性登革病毒减毒株及其应用，属于生物


技术介绍

[0002]目前已有多种登革病毒候选疫苗进入临床研究阶段，包括减毒活疫苗、灭活疫苗、亚单位疫苗、核酸疫苗等，多处于I期/II期临床研究阶段，进展到III期/IV期临床研究的均为减毒活疫苗，具体包括：Dengvaxia（赛诺菲，法国）、DENVax（武田制药，日本）和TetraVax（布坦坦研究所，巴西）。
[0003]其中，Dengvaxia是由黄热病17D株的非结构基因分别与4种血清型登革病毒的结构前膜和包膜基因嵌合体组成。另外，TDV（Dengvaxia）是使用2型登革病毒株PDK
‑
53作为骨架，用1型登革病毒、3型登革病毒和4型登革病毒的前膜和包膜基因编码序列替换PDK
‑
53对应前膜和包膜基因编码序列，重组RNA（Ribonucleic Acid）转染Vero细胞生产获得的减毒嵌合四价登革热活疫苗。
[0004]针对TDV的临床研究结果显示，疫苗的总保护效力在III期临床试验中达到80.2%，疫苗在IV期临床试验中保护90.14%登革病毒感染后避免住院。总体TDV免疫耐受性普遍良好，没有证据表明疫苗接受者的疾病会加重，未发现重大使用风险。TV003/TV005（DENVax）是基于四种改造的登革病毒株生产的四价减毒活疫苗，即删除登革病毒非翻译区30或31个核苷酸获得的病毒株1型rDENV1D30、3型rDENV3D30/31、4型rDENV4D30，以及将2型登革病毒前膜和包膜基因编码序列替换到4型rDENV4D30中获得的2型rDENV2/4D30。临床研究结果显示，接种TV003后，91.7%的受试者检测到四种DENV血清型的抗体。
[0005]上述同类技术存在以下缺点：Dengvaxia是目前唯一一个获批在国外多个国家/地区使用的疫苗，报道称保护性能持续4年，但该疫苗接种后可能诱发再次感染者患重症登革热几率增加的副作用。且目前该疫苗未在我国上市，对中国人群的免疫保护性和副作用不明。
[0006]TDV和TV003/TV005尚未在中国开展临床试验，对中国人群的免疫保护性和副作用不明确。
[0007]上述减毒活疫苗均采用的是嵌合重组病毒技术，与本专利技术使用的连续梯度减毒技术不同。另外，上述三种候选减毒活疫苗使用的病毒株骨架均基于国外流行株，而不是中国流行的病毒株，后续引进中国并应用可能带来不同病毒株交叉保护性不足的问题。

技术实现思路

[0008]为解决上述问题，本专利技术提供一种Vero细胞适应性登革病毒减毒株及其应用，以分离于中国云南西双版纳地区的登革病毒流行株DV
‑
24C5（其分类命名为Dengue virus DV
‑
24C5）为基础，将其培养于绿猴肾细胞（Vero细胞）中进行适应，获得Vero细胞适应性的登革病毒DV
‑
V37（其分类命名为Dengue virus DV
‑
V37），进一步通过降温培养获得登革病毒DV
‑
V28（其分类命名为Dengue virus DV
‑
V28）。
[0009]所述登革病毒DV
‑
24C5已于2023年8月11日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC，地址中国武汉，武汉大学），保藏编号为CCTCC NO：V202386。
[0010]所述登革病毒DV
‑
V37已于2023年6月1日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC，地址中国武汉，武汉大学），保藏编号为CCTCC NO：V202354。
[0011]所述登革病毒DV
‑
V28已于2023年6月1日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC，地址中国武汉，武汉大学），保藏编号为CCTCC NO：V202355。
[0012]研究结果表明DV
‑
V37和DV
‑
V28均能稳定感染Vero细胞，且DV
‑
V28相比DV
‑
V37毒力减弱，可作为登革病毒减毒活疫苗研发的病毒骨架。DV
‑
V28是基于我国境内流行的病毒株开发的减毒登革病毒株，与中国境内其他2型登革病毒流行株进化关系更近，具有较国外流行病毒株提供更高交叉免疫保护的优点。
[0013]本专利技术还提供Vero细胞适应性登革病毒减毒株的制备方法，经过下列各步骤：（1）分离获得登革病毒株DV
‑
24C5：通过幼蚊细胞（C6/36细胞）培养登革热患者血清中的病毒DV
‑
24C5；（2）培养和分离登革病毒株DV
‑
V37：通过将DV
‑
24C5培养于Vero细胞中，经过在37℃环境下连续传代培养，获得感染性稳定的病毒株DV
‑
V37；（3）培养和分离登革病毒株DV
‑
V28：通过将DV
‑
V37培养于Vero细胞中，经过在35℃、33℃、30℃、28℃环境中连续传代培养，获得感染性稳定的病毒株DV
‑
V28。
[0014]测定上述DV
‑
24C5病毒株、DV
‑
V37病毒株、DV
‑
V28病毒株基因信息，基因序列如SEQIDNO：1、SEQIDNO：2、SEQIDNO：3，其中DV
‑
V37、DV
‑
V28的蛋白序列如SEQIDNO：4、SEQIDNO：5。
[0015]本专利技术通过测定DV
‑
V37病毒株和DV
‑
V28病毒株的体外感染性，主要包括利用猴肾细胞测定生长曲线，利用荧光定量法检测病毒基因，利用荧光定量PCR方法检测2型登革病毒基因拷贝数；基于前述所得数据，比较DV
‑
V37和DV
‑
V28病毒感染Vero细胞的毒力差异；测定DV
‑
V37病毒株和DV
‑
V28病毒株的体内感染性和免疫原性，主要利用I型干扰素受体（IFNAR）缺陷小鼠分别感染DV
‑
V37与DV
‑
V28，通过检测体重、病毒血症作为感染判定指标，通过测定血清中中和抗体水平作为免疫原性判定指标；基于前述所得数据，比较DV
‑
V37和DV
‑
V28病毒的体内毒力差异，并判定DV
‑
V37和DV
‑
V28病毒的免疫原性。
[0016]进而得出：本专利技术所述登革病毒株DV
‑
24C5可稳定感染C6/36细胞，使感染病毒的幼蚊细胞病变；本专利技术所述登革病毒株DV
‑
V37可稳定感染Vero细胞，在37℃环本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种Vero细胞适应性登革病毒减毒株DV
‑
V28其在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：V202355。2.权利要求1所述Vero细胞适应性登革病毒减毒株DV
‑
V28在登革病毒减毒活疫苗制备中的应用。3.权利要求1所述Vero细胞适应性登革病毒减毒株DV
‑
V28的制备方法，其特征在于经过下列各步骤：（1）分离获得登革病毒株DV
‑
24C5：通过幼蚊细胞培养登革热患者血清中的病毒DV
‑
24C5；（2）培养和分离登革病毒株DV
‑
V37：通过将DV
‑
24C5培养于Vero细胞中，经过在37℃环境下连续传代培养，...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙强明，邱丽娟，潘玥，陈俊英，
申请(专利权)人：中国医学科学院医学生物学研究所，
类型：发明
国别省市：