一种鸡血管紧张素转换酶2（制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，特别涉及一种单克隆抗体

【技术实现步骤摘要】
一种鸡血管紧张素转换酶2(ACE2)单克隆抗体的制备


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种鸡的血管紧张素转换酶
2(Angiotensin converting enzyme 2
，
ACE2)
的单克隆抗体的制备
。

技术介绍

[0002]血管紧张素转换酶
2(Angiotensin converting enzyme 2
，
ACE2)
是
2000
年发现的肾素血管紧张素系统
(RAS)
的重要一员，通过降解
AngII
和产生血管紧张素1‑
7(Angiotensin1
‑7，
Ang1
‑
7))
抵消血管紧张素转换酶
(Angiotensin converting enzyme
，
ACE)
的作用，为
RAS
建立了保护轴
(
即
ACE2
‑
Ang1
‑7‑
Mas
轴
)。
已证明该轴通过阻断细胞凋亡，纤维化，氧化应激和炎症而有效地产生对代谢，免疫和心血管功能障碍的有益作用，从而改善代谢功能障碍等
。ACE2
表达水平的高低与机体稳态的维持有显著的联系
。
[0003]目前，关于
ACE2
的检测方法主要集中在实时荧光定量
PCR、Westem blot
和
ELISA
等方法
。
实时荧光定量
PCR
和
Westem blot
，实验步骤繁琐，需花费大量时间，不适用于大量样品的快速检测
。ELISA
检测方法因其具有高选择性和灵敏性
、
快速等特点，在
ACE2
的定量检测领域得到广泛的应用
。
至今为止，应用于
ELISA
方法的商品化
ACE2
一抗，都是用抗原片段制备，不同公司选用的片段不一样，根据选择片段保守与否，而导致制备的抗体具有一定的物种特异性
。
此外，大多数商品化的
ACE2
一抗都是应用于人
、
鼠等动物，而缺乏应用于禽类的
ACE2
一抗，制约了
ACE2
在禽类的功能研究
。
因此，制备应用于禽类的
ACE2
一抗，并基于此建立鸡
ACE2
定量检测方法显得尤为重要
。
[0004]在本专利技术研究中，利用原核表达系统表达了
pET32a
‑
ACE2
重组蛋白，通过纯化
pET32a
‑
ACE2
重组蛋白制备鼠鸡
ACE2
单克隆抗体
。
本专利技术研究为
ACE2
在鸡等禽类方面的功能研究提供方法和检测依据
。
[0005]有鉴于此，特提出本专利技术
。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是根据
ACE2
作为
RAS
系统的负调节分子，通过靶向降解
AngII
，发挥抗损伤
、
抗纤维化等机体保护功能；作为急性严重呼吸系统综合征冠状病毒
(SARS
‑
CoV)
主要功能性受体，具有保护肺损伤的功能；协同氨基酸转运载体转运，与氨基酸吸收不良
、
肠道微生态平衡和胃肠道炎症所发挥的关键作用，以及到目前为止缺乏应用于禽类的
ACE2
抗体，通过原核表达
ACE2
蛋白并制备相应的单克隆抗体，还可以为
ACE2
在鸡等禽类方面的功能研究提供方法和检测依据
。
[0007]为实现上述目的，本专利技术采用以下的技术方案为：
[0008]一种鸡的
ACE2
单克隆抗体的制备方法，其包括以下步骤：
[0009]S1、
将鸡的
ACE2
原核表达载体，转入
BL21
感受态细胞中，经
IPTG
诱导表达后，获得
pET32a
‑
ACE2
重组蛋白，然后经
KCl
染色，切下染成银白色的目的条带，加入
PBS
震荡混匀，
‑
20℃
反复冻融3次，获得纯化后的
ACE2
重组蛋白
。
[0010]S2、
实验组5只
SPF
级
BALB/c
雌性小鼠，分别断尾采血
(
作阴性对照
)
，然后免疫
。
首次免疫：将弗氏完全佐剂与
250ug
抗原充分混匀
。
每只实验组老鼠皮下免疫4个部位，每个部位
450uL。
免疫周期为
56
天，总共免疫4次
。
四次免疫后第
7d
，间接
ELISA
测定效价
。
[0011]S3、
取实验组小鼠脾脏，分离出脾脏细胞，与小鼠骨髓瘤细胞
SP2/0
以
10∶1
的细胞数比例混合，离心后于细胞沉淀中加入融合剂
PEG4000
进行融合，转入
96
孔板中用含1％
HAT
的选择性培养基筛选，以后每隔2天对半换液，
10
‑
14d
取细胞培养上清进行
ELISA
检测筛选
。
[0012]S4、
为筛选鼠抗
ACE2
单克隆抗体效价，抗原
ACE2
蛋白包被的
ELISA
板，加入细胞培养上清，
37℃
孵育1小时，
PBST
洗涤5次后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠
IgG
二抗，
37℃
孵育1小时，
PBST
洗涤5次后加入
TMB
底物显色，
2M H2SO4终止反应，酶标仪读数
OD450。
获得了一株结合
ACE2
蛋白强阳性的杂交瘤细胞
。
进而对杂交瘤细胞采用有限稀释法进行单克隆化，将杂交瘤细胞扩大培养后冻存保种
。
[0013]S5、
小鼠在注射杂交瘤细胞前5‑
7d
，预先腹腔注射
Pristane
，取杂交瘤细胞腹腔注射，
10
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种特异性结合鸡
ACE2
蛋白的单克隆抗体，由
BALB/c
小鼠制备
。2.
一种杂交瘤细胞株，其产生的单克隆抗体的效价为
1∶512000。3.
如权利要求1所述的单克隆抗体抗体以白羽肉鸡
pET32a
‑
ACE2
重组蛋白为抗原
。4.
如权利要求1所述的单克隆抗体纯化为亲和层析纯化
。5.
如权利要求1所述的单克隆抗体由腹水制备
。6.
如权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：张源淑，纪晓霞，马畅，张亚峰，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：