一种捕获单个循环肿瘤细胞的方法、芯片及其应用技术

本发明专利技术属于生物医学技术领域，具体涉及一种捕获单个循环肿瘤细胞的方法、芯片及其应用。所述米多孔氧化石墨烯芯片的制备方法包括如下步骤：将氧化石墨烯置于十八烷基氯化铵的氯仿溶液中形成氧化石墨烯/双十八烷基二甲基溴化溶液，记作GO/DODA溶液，将GO/DODA溶液旋涂至基体表面，形成纳米多孔氧化石墨烯基底，对纳米多孔氧化石墨烯基底依次进行硅烷化处理、酰胺化处理，然后键合上链霉亲和素，最后修饰抗体，得到所述纳米多孔氧化石墨烯芯片。本发明专利技术的纳米多孔氧化石墨烯芯片可以高效率和高敏感性捕获外周血中的循环肿瘤细胞(CTCs)，红外激光照射原位释放单个CTC，最大限度保护CTC的活性，使得单个CTC可满足单细胞转录组高通量测序要求。通量测序要求。通量测序要求。

【技术实现步骤摘要】
一种捕获单个循环肿瘤细胞的方法、芯片及其应用


[0001]本专利技术属于生物医学
，具体涉及一种捕获单个循环肿瘤细胞的方法、芯片及其应用。

技术介绍

[0002]循环肿瘤细胞(CTCs)作为实体瘤的“液态”标本，可实现便捷、无创、反复地采集。CTCs蕴含着不同阶段的癌症基因变化信息，且CTCs表现出与原发肿瘤相同的时空异质性。因此，CTCs的这些特征有助于监测肿瘤的进展和治疗过程中的适应性，即监测肿瘤演化和治疗过程中获得性耐药。但外周血中CTCs非常罕见，因此对CTCs的鉴定和分离在技术上具有一定的挑战性。更重要的是，肿瘤异质性会掩盖CTCs中个别代表癌症演化的CTC小组群的基因分型特征，所以需要在单细胞层面对CTCs进行逐一筛查。其次，要精准检测和治疗手段有关的基因变化(抗性)，必须提供转录组的基因测序信息。这就要求CTCs分离完整且保护单个CTC的活度。
[0003]目前获得单个CTC的方法主要有激光显微切割，流式细胞仪的方法，但这些方法都可能影响单个CTC的结构和活性，不能满足后续的生物学分析要求。

技术实现思路

[0004]本专利技术所解决的技术问题是捕获单个CTC中如何更好地保留细胞的结构和活性。
[0005]为此，本专利技术的目的之一是提供一种纳米多孔氧化石墨烯芯片的制备方法，包括如下步骤：
[0006]将氧化石墨烯置于十八烷基氯化铵的氯仿溶液中形成氧化石墨烯/双十八烷基二甲基溴化溶液，记作GO/DODA溶液，将GO/DODA溶液旋涂至基体表面，形成纳米多孔氧化石墨烯基底，对纳米多孔氧化石墨烯基底依次进行硅烷化处理、酰胺化处理，然后键合上链霉亲和素，最后修饰抗体，得到所述纳米多孔氧化石墨烯芯片。
[0007]进一步的，制备GO/DODA溶液具体步骤为：
[0008]11)由天然石墨制备得到氧化石墨烯，超声、离心，取出上层溶液；
[0009]12)将含有的十八烷基氯化铵的氯仿溶液滴加到上层溶液中，当上层溶液变成棕黄色时停止滴加，取出下层有机相溶液，得到化石墨烯/双十八烷基二甲基溴化溶液，记作GO/DODA溶液。
[0010]更进一步的，步骤11)中，氧化石墨烯依次经过超声3.5
‑
4小时，8000转离心30
‑
40分钟，14000转离心30
‑
40分钟。
[0011]更进一步的，硅烷化处理具体步骤为：
[0012]将纳米多孔氧化石墨烯基底浸入浓度为1.8
‑
2nM的1；2
‑
(三乙氧基硅基)乙烷溶液中，5
‑
8℃，反应1.5
‑
2h。
[0013]更进一步的，酰胺化处理具体步骤为：
[0014]将硅烷化处理的纳米多孔氧化石墨烯基底浸入5
‑
6nM的1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐溶液中，再加入N
‑
羟基丁二酰亚胺，共价连接形成酰胺键,锚定于纳米多孔氧化石墨烯基底上。
[0015]更进一步的，键合上链霉亲和素具体步骤为：
[0016]用磷酸盐缓冲液将链霉亲和素稀释至浓度为18
‑
20μg/mL，将酰胺化的纳米多孔氧化石墨烯基底置于其中，室温下放置4
‑
5h。
[0017]更进一步的，将浓度为1.8
‑
2nM的抗体滴加到键合上链霉亲和素的纳米多孔氧化石墨烯基底上，室温放置1
‑
1.5h，然后洗去未连接的抗体，制得纳米多孔氧化石墨烯芯片。
[0018]本专利技术的目的之二是提供所述制备方法制得的纳米多孔氧化石墨烯芯片。
[0019]本专利技术的目的之三是提供所述纳米多孔氧化石墨烯芯片在制备捕获单个循环肿瘤细胞的产品中的应用。
[0020]本专利技术的目的之四是提供一种捕获单个循环肿瘤细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0021]将所述纳米多孔氧化石墨烯芯片与待测血液混合孵育，再通过原位的红外脉冲激光短暂照射，逐一进行释放，并由微流带出芯片，即可获得单个循环肿瘤细胞；所述红外脉冲激光波长为760nm，照射时间为10
‑
11min。
[0022]本专利技术具有如下有益效果：
[0023]本专利技术利用氧化石墨烯(Graphene Oxide,GO)所含的不同种类的含氧官能团与连接剂反应，将连接剂插入GO层间，直接导致GO的层间距增大，从而丰富了自身的孔结构，提高了比表面积。在连接剂的选取也很灵活，只要是能与氧化石墨烯的含氧官能团反应的分子都可以，可以是高分子化合物、有机分子、金属络合物、氨基酸、蛋白、多肽等。通过蒸镀和气相沉积等方法，可产生纳米孔结构，即构成纳米多孔氧化石墨烯。在此，我们利用纳米多孔氧化石墨烯制备纳米结构芯片，通过系统的表面生物功能化修饰，可在其表面多孔结构上导入生物素，然后键合上链霉亲和素。这样表面可以修饰任何偶联了生物素的捕获抗体。再利用微流体体系和制备的纳米氧化石墨烯芯片。
[0024]利用纳米氧化石墨烯芯片捕获病人血样中的CTCs，再通过原位的红外脉冲激光短暂照射，逐一进行释放，并由微流带出芯片，即可获得单个循环肿瘤细胞。
[0025]本专利技术的纳米多孔氧化石墨烯芯片可以高效率和高敏感性捕获外周血中的CTCs，红外激光照射原位释放单个CTC，最大限度保护CTC的活性，使得单个CTC可满足单细胞转录组高通量测序要求。
附图说明
[0026]图1为实施例1的制备纳米多孔氧化石墨烯芯片的流程示意图。
[0027]图2为实施例2的捕获单个CTC的流程示意图。
[0028]图3为现有技术和本专利技术获得的单个循环肿瘤细胞的荧光图。
具体实施方式
[0029]下面结合附图和具体实施例对本专利技术进行详细说明，但不应理解为本专利技术的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0030]实施例1：纳米多孔氧化石墨烯芯片的制备
[0031]参照图1，纳米多孔氧化石墨烯芯片的制备包括以下步骤：
[0032](1)配制GO/DODA复合材料的氯仿溶液
[0033]11)利用Hummers法将天然石墨经过两步氧化得到氧化石墨烯，240W超声4小时，8000转离心30分钟，然后高速离心14000转30分钟，取出上层溶液使用氢氧化钠溶液将pH调到9，记作溶液I；
[0034]12)将含有1mg/mL的十八烷基氯化铵(DODA)氯仿溶液滴加到溶液I中，当溶液I变成棕黄色时停止滴加，取出下层有机相溶液，得到化石墨烯/双十八烷基二甲基溴化铵(GO/DODA)溶液；
[0035](2)将GO/DODA溶液旋涂在玻璃片表面，然后静置并通入水汽，加热到60℃，挥发掉有机溶剂，形成纳米多孔本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种纳米多孔氧化石墨烯芯片的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将氧化石墨烯置于十八烷基氯化铵的氯仿溶液中形成氧化石墨烯/双十八烷基二甲基溴化溶液，记作GO/DODA溶液，将GO/DODA溶液旋涂至基体表面，形成纳米多孔氧化石墨烯基底，对纳米多孔氧化石墨烯基底依次进行硅烷化处理、酰胺化处理，然后键合上链霉亲和素，最后修饰抗体，得到所述纳米多孔氧化石墨烯芯片。2.根据权利要求1所述的一种纳米多孔氧化石墨烯芯片的制备方法，其特征在于，制备GO/DODA溶液具体步骤为：11)由天然石墨制备得到氧化石墨烯，超声、离心，取出上层溶液；12)将含有的十八烷基氯化铵的氯仿溶液滴加到上层溶液中，当上层溶液变成棕黄色时停止滴加，取出下层有机相溶液，得到化石墨烯/双十八烷基二甲基溴化溶液，记作GO/DODA溶液。3.根据权利要求2所述的一种纳米多孔氧化石墨烯芯片的制备方法，其特征在于，步骤11)中，氧化石墨烯依次经过超声3.5
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4小时，8000转离心30
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40分钟，14000转离心30
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40分钟。4.据权利要求3所述的一种纳米多孔氧化石墨烯芯片的制备方法，其特征在于，硅烷化处理具体步骤为：将纳米多孔氧化石墨烯基底浸入浓度为1.8
‑
2nM的1；2
‑
(三乙氧基硅基)乙烷溶液中，5
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8℃，反应1.5
‑
2h。5.据权利要求4所述的一种纳米多孔氧化石墨烯芯片的制备方法，其特征在于，酰胺...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈庆林，姚伟荣，王云龙，蒋飘，桂绍高，范兵，曾麟，周志勇，毛志方，
申请(专利权)人：江西省人民医院，
类型：发明
国别省市：