一种能够检测中药注射剂微量蛋白的检测方法，用于检测中药注射剂蛋白质类杂质，以控制中药注射剂的质量。其特征在于按以下步骤进行：１）先将蛋白质特异性吸附膜浸泡在拟检测的中药注射剂溶液中；２）用含有有机溶剂的溶液洗涤蛋白质吸附膜，以消减中药注射剂本身的颜色干扰；３）将蛋白质吸附膜进行考马斯亮蓝显色。如果中药注射剂所含的蛋白质不低于０．５μｇ／ｍｌ，就会在膜上显示稳定可辨的蓝色。本发明专利技术的检测灵敏度高，同时具有较强的抗干扰能力，适用于所有中药注射剂微量蛋白质的检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及中药注射剂杂质检测领域，用于检测中药注射剂蛋白质类杂质，以控 制中药注射剂的质量。
技术介绍
中药注射剂最早产生在上世纪四十年代，由钱信忠等学者开创。在中国，中药注射 剂已经广泛应用于临床。2010年版《中华人民共和国药典》(简称《中国药典》)一部就收 录有灯盏细辛、清开灵、止喘灵及双黄连等单方和复方注射剂。中药注射剂在推进中药剂型 发展，拓展中药的应用范围，服务广大人民健康等方面的确功不可没。安全、有效、质量可控 依然是中药注射剂的基本质量要求。从技术上来讲，业界大体上已经解决了中药注射剂的 有效性问题(尽管作用机制尚不完全清楚)，对于安全性依然是业界难题。然而，随着中药注射剂的广泛应用于临床，其不良反应日益暴露，特别是致死性不 良反应也屡有报道。根据目前公开的不良反应资料，中药注射剂的不良反应可以累及各个 系统和脏器，甚至导致死亡。很多中药注射剂的不良反应与原有的药理作用无关，根据多方 面分析，这些不良反应主要属于超敏反应，即病理性免疫反应，包括I、II、III和IV型病理 性免疫反应。病理性免疫反应仍是免疫反应，必须有抗原的参与，其抗原可以是半抗原或完 全抗原。半抗原多属于小分子成分，完全抗原多为大分子成分，以蛋白质最为多见。因此减 少中药注射剂中的抗原性成分是提高中药注射剂安全性的关键策略之一。中药注射剂大多为植物提取物。作为生物提取物，在原料提取过程中会带来多种 植物大分子杂质，如蛋白质、核酸等。尽管植物中的蛋白质含量较低，通过有机溶剂提取的 量较少，但微量的蛋白仍足以诱发过敏反应。与人相比，植物蛋白与人的同源性差异大，因 此常常具有很强的抗原性。现行《中国药典》(2010年版)控制中药注射剂蛋白含量的方法 仍沿用了以前的磺基水杨酸比浊法，控制的蛋白质限量约为37 110μ g/ml左右，低于此 限量的蛋白药典方法很难检出。因此，蛋白含量低于37 μ g/ml的中药注射剂将被视为“合 格”。而且中药注射剂中的酸性成分会干扰磺基水杨酸法检测蛋白的结果，这导致磺基水杨 酸法应用范围受限。而其他未被药典采用的蛋白质检测方法如，凯氏(Kjeldahl)定氮法、 双缩脲法、Folin-酚试剂法、直接考马斯亮兰法(Bradford法)、紫外吸收法以及BCA法等， 却因为中药注射剂其他成分或本身颜色带来严重干扰，要么特异性较差，要么灵敏度较差， 不适合用于中药注射剂的蛋白质限量检测。蛋白质类杂质属于一类杂质，包含了不同性质 或分子量的蛋白质，因此也很难用HPLC和/或质谱等仪器分析方法进行检测。中药注射剂中存在的微量蛋白成分带来了安全性问题，从严控制中药注射剂中的 蛋白质杂质，有利于提高中药注射剂的安全性。因此建立特异性高并且灵敏的中药注射剂 蛋白质检测方法很有必要。由于中药注射剂都有较深的颜色，成分多样，而且蛋白质是一类物质，因此很难用 目前单一方法同时提高检测的灵敏性和特异性。因此本专利技术是针对中药注射剂的特点而建 立的，对蛋白质检测具有灵敏度高、抗干扰能力强的特点。3在我们申请的前一项专利(201010199693.3)中，我们专利技术了一种检测中药注射 剂的微量蛋白方法，检测的灵敏度约为12μ g/ml，比2010年版《中国药典》方法高3倍左 右。在本专利中，我们参照专利(201010199693.3)的原理将方法进行了改进，检测的灵敏度将得到进一步的提高。
技术实现思路
本专利技术利用某些膜能和蛋白质特异性高强度吸附的特点以及考马斯亮蓝对蛋白 质特异性显色的特点建立本方法，以提高中药注射剂微量蛋白检测的灵敏性和特异性。本 方法包括以下三个步骤1、先将蛋白质特异性吸附膜浸泡在拟检测的中药注射剂溶液中；2、用含有有机溶剂的溶液洗涤蛋白质吸附膜，以消减中药注射剂本身的颜色干 扰；3、将蛋白质吸附膜进行考马斯亮蓝显色。在以上步骤1中，吸附蛋白质的膜包括但不限于硝酸纤维素膜、尼龙膜、PVDF膜 (Polyvinylidene fluoride，聚偏二氟乙烯膜)；浸泡于中药注射剂溶液中蛋白质吸附膜的 面积大小为Imm2-O. Im2 ；浸泡蛋白质吸附膜的中药注射剂溶液的体积0. Iml-IOOOml ；中药 注射剂溶液包括但不限于中药注射液、中药注射用冻干粉针剂及其稀释或浓缩液。在以上步骤2中，采用的有机溶液浓度为0-100 %，有机溶剂包括但不限于甲醇、 乙醇、乙腈、丙酮、氯仿。采用有机溶液洗涤的量和洗涤的次数不限，以去除或减弱中药注射 剂本色为度。如果被中药注射剂溶液浸泡后的蛋白质吸附膜几乎无色，本步骤可以跳过直 接进入步骤3。在步骤3进行考马斯亮蓝显色时，考马斯亮蓝的浓度不限。可以对膜片直接染色； 也可以染色后进行脱色处理，以降低膜的背景。含有一定蛋白质浓度的中药注射剂会显示 出稳定的蓝色。本方法各步骤较佳参考条件是步骤1)选用蛋白质吸附膜为PVDF膜，膜的面积控制在IOmm2内，采用中药注射原 液，浸泡的体积为10ml。步骤2)洗涤用的有机溶媒采用纯甲醇或乙腈。步骤3)采用0.25%考马斯亮蓝染液先染色，随后用脱色液(甲醇-水-冰醋酸= 4.5 4.5 1)脱色，脱色操作以空白对照膜片基本无色为度。本方法实施的效果是，检测的特异性高，抗干扰能力强，但灵敏性更高。附图说明图1为PVDF膜吸附染色检测微量蛋白质获得的初步染色结果图从A3至A9， BSA(牛血清白蛋白)浓度依次均为 0. 33mg/ml、0. lmg/ml、37 μ g/ml、12 μ g/ml、4 μ g/ml、 1. 3 μ g/ml、0. 45 μ g/ml, A13为阴性对照，蛋白质浓度为0 ；浸泡吸附体系1ml。图2为本专利技术的灵敏度优化实验结果图最上1行采用IOml浸泡吸附体系，中间 为5ml浸泡吸附体系，最下一行为2ml浸泡吸附体系；从A7至A12，BSA浓度依次均为4 μ g/ mlU. 3 μ g/ml,0. 45 μ g/ml,0. 15 μ g/ml,0. 05 μ g/ml,0. 016 μ g/ml, A13 为阴性对照，蛋白4质浓度为0。图3为本专利技术吸附时间优化的结果图第1 5行的浸泡吸附时间分别为1小时、2 小时、5小时、10小时和15小时；A8 AlO的BSA浓度为1. 3μ g/ml,0. 45μ g/ml,0. 15 μ g/ ml, A13为阴性对照，蛋白质浓度为0 ；浸泡吸附体积为10ml。图4为本专利技术用于检测4种中药注射液的结果图步骤1为浸泡吸附15小时后直 接风干的PVDF膜颜色，步骤2为膜片经步骤1后再经甲醇洗涤后的结果，步骤3为PVDF膜 分别在4种中药注射液中浸泡15小时后经甲醇洗涤并经考马斯亮蓝染色的结果；1为丹参 注射液、2为双黄连注射液、3为清开灵注射液、4为灯盏细辛注射液、A13为阴性对照(即不 含蛋白质的PBS溶液)。具体实施例方式实施示例1改变检测方法，发现检测灵敏度得到提高取13 支 1. 5ml 试管，管编号 A0-A12，用 PBS(KC1，0. 2g ；KH2PO4,0. 2g ；NaCl，8. Og ； Na2HPO4 · 12Η20，2· 08g ；加三蒸水到1000ml, pH 7. 2)和BSA(牛血清白蛋白)配制出浓度 为9mg/ml的BSA溶液本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：段为钢，李奇峰，柯瑾，吕小满，
申请(专利权)人：云南中医学院，
类型：发明
国别省市：53
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