Cas3/Cascade制造技术

本发明专利技术涉及生物检测技术领域，提供了一种源于嗜热古细菌的

【技术实现步骤摘要】
Cas3/Cascade蛋白复合物、CRISPR/Cas系统及其检测方法与应用


[0001]本专利技术涉及生物检测
，尤其涉及一种源于嗜热古细菌
typeI
‑
A
型的
Cas3/Cascade
蛋白复合物
、CRISPR/Cas
系统及其核酸分子检测方法与应用
。

技术介绍

[0002]成簇规律间隔短回文重复序列
(clustered regularly interspaced short palindromic repeats
，
CRISPR)/
成簇规律间隔短回文重复序列相关蛋白
(clustered regularly interspaced shortpalindromic repeat
‑
associated protein)
系统是细菌和古细菌在生物进化过程中形成的一种适应性免疫防御系统
。
自从发现
Cas13
和
Cas12
蛋白具有
"
附带切割
"
活性，并将其用于快速分子检测，基于
CRISPR/Cas
系统的核酸检测技术在病原体检测
、
遗传病检测
、
癌症检测
、
微生物耐药性检测
、
环境微生物检测等领域的应用增长迅速
。
由于
CRISPR/Cas
系统具有快速
、
成本低廉
、
高灵敏度
、
高特异性等优势，被称作为新型的
"
下一代分子诊断系统
"。
[0003]目前，应用于
CRISPR/Cas
核酸检测的
Cas
蛋白主要是
type V
型的
Cas12a、Cas12b、Cas12c、Cas12g、Cas14
和
type VI
型的
Cas13a、Cas13b
等
。
其中，基于
Cas13
的
SHERLOCK
核酸检测方法，只能特异性识别
RNA
序列，且因其酶切的
RNA
探针容易水解，大大限制了
Cas13
进一步应用和发展
。
基于
Cas12
的开发的
DETECTR
和
HOLMES
技术，其检测的底物可以是双链
DNA
，也可以是单链
DNA
，但不能应用于
RNA
靶标检测
。

技术实现思路

[0004]本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种源于嗜热古细菌
(Thermococcus siculi,Tsi)typeI
‑
A
型的
Cas3/Cascade
蛋白复合物
、CRISPR/Cas
系统及其核酸分子检测方法与应用，该
Cas3/Cascade
蛋白复合物包括
TsiCas3
和
TsiCascade
；本专利技术中，向导
RNA
与
TsiCascade
共表达原位产生，再与
TsiCas3
孵育结合形成
TsiCas3/Cascade
‑
gRNA
效应蛋白复合物，所述效应蛋白复合物通过向导
RNA
与靶核酸分子
(dsDNA、ssDNA、ssRNA)
内的靶序列之间的碱基配对被靶向至靶核酸中的特定位点
。
[0005]本专利技术采用以下技术方案解决上述技术问题：
[0006]本专利技术提供了一种
Cas3/Cascade
蛋白复合物，源于嗜热古细菌，为
TsiCas3/Cascade
蛋白复合物；所述
TsiCas3/Cascade
蛋白复合物包括
TsiCas3
和
TsiCascade
；其中，所述
TsiCas3
包括
Cas3HD、Cas3HEL
蛋白；所述
TsiCascade
包括
Cas5、Cas6、Cas7、Cas8
和
Cas11
蛋白
。
[0007]作为本专利技术的优选方式之一，所述
TsiCas3
中，
Cas3HD
蛋白对应基因序列如
SEQ ID NO.1
所示，
Cas3HEL
蛋白对应基因序列如
SEQ ID NO.2
所示
。
[0008]作为本专利技术的优选方式之一，所述
TsiCascade
中，
Cas5、Cas7、Cas8
和
Cas11
蛋白对应基因序列分别如
SEQ ID NO.3
～
SEQ ID NO.6
所示，
Cas6
蛋白对应基因序列与靶标选择相
应
。
[0009]作为本专利技术的优选方式之一，所述
Cas3/Cascade
蛋白复合物还可以是具有与上述
TsiCas3/Cascade
蛋白复合物旁路单链
DNA
切割活性类似的其他
Cas3/Cascade
效应蛋白复合物
。
[0010]作为本专利技术的优选方式之一，所述
Cas3/Cascade
除了上述
TsiCas3/Cascade
，还可以是
PfuCas3/Cascade、Mri/Cas3/Cascade、Fpl/Cas3/Cascade、Biz/Cas3/Cascade、Pyn/Cas3/Cascade、Lwl/Cas3/Cascade、Ttd/Cas3/Cascade、Tsg/Cas3/Cascade、Tga/Cas3/Cascade、Pfi/Cas3/Cascade、Pyc/Cas3/Cascade、MjaCas3/Cascade、Tsl/Cas3/Cascade。
[0011]本专利技术还提供了一种
typeI
‑
A
型
CRISPR/Cas
系统，包括上述
Cas3/Cascade
蛋白复合物
。
[0012]作为本专利技术的优选方式之一，包括
Cas3/Cascade
蛋白复合物
、
向导
RNA、ssDNA
探针；其中，所述向导
RNA
与所述
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种
Cas3/Cascade
蛋白复合物，其特征在于，源于嗜热古细菌，包括
TsiCas3
和
TsiCascade
；其中，所述
TsiCas3
包括
Cas3HD、Cas3HEL
蛋白；所述
TsiCascade
包括
Cas5、Cas6、Cas7、Cas8
和
Cas11
蛋白
。2.
根据权利要求1所述的
Cas3/Cascade
蛋白复合物，其特征在于，所述
TsiCas3
中，
Cas3HD
蛋白对应基因序列如
SEQ ID NO.1
所示，
Cas3HEL
蛋白对应基因序列如
SEQ ID NO.2
所示
。3.
根据权利要求1所述的
Cas3/Cascade
蛋白复合物，其特征在于，所述
TsiCascade
中，
Cas5、Cas7、Cas8
和
Cas11
蛋白对应基因序列分别如
SEQ ID NO.3
～
SEQ ID NO.6
所示，
Cas6
蛋白对应基因序列与靶标选择相应
。4.
一种
typeI
‑
A
型
CRISPR/Cas
系统，其特征在于，包括如权利要求1～3任一所述的
Cas3/Cascade
蛋白复合物
。5.
根据权利要求4所述的
typeI
‑
A
型
CRISPR/Cas
系统，其特征在于，包括
Cas3/Cascade
蛋白复合物
、
向导
RNA、ssDNA
探针；其中，所述向导
RNA
与所述
Cas3/Cascade
蛋白复合物中的
Cascade
原位共表达，与所述
Cascade
结合，且同时与靶
DNA/RNA
杂交序列结合；所述
ssDNA
探针不与所述向导
RNA
序列杂交
。6.
一种基于
typeI
‑
A
型
CRISPR/Cas
系统的核酸分子检测方法，其特征在于，采用如权利要求4～5任一所述的
CRISPR/Cas
系统，包括如下步骤：
(1)
使样品靶核酸与以下物质接触：
(i)Cas3/Cascade
蛋白复合物；
(ii)
向导
RNA
；所述向导
RNA
与
Cascade
原位共表达，与
Cascade
结合，且同时与靶核酸杂交序列结合；
(iii)ssDNA
探针；所述
ssDNA
探针不与所述向导
RNA
序列杂交；
(2)
测量由所述
Cas3/Cascade
蛋白复合物在一定时间和适宜温度条件下孵育
、
并酶切
ssDNA
探针而产生的检测信号，从而检测所述样品靶核酸
。7.
根据权利要求6所述的基于
typeI
‑
A
型
CRISPR/Cas
系统的核酸分子检测方法，其特征在于，所述步骤
(1)
中，样品为唾液
、
口咽拭子
、
鼻咽拭子
、
血液
、
血清
、
血浆
、
尿液
、
粪便
、
抽吸物
、
活检组织
、
真核细胞
、
细菌细胞或古细菌细胞
。8.
根据权利要求6所述的基于
typeI
‑
A...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡涛，胡纯一，
申请(专利权)人：新加坡国立大学，
类型：发明
国别省市：