肺前体样细胞的制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种肺前体样细胞的制备方法和应用，肺前体样细胞的制备方法，包括以下步骤：取肺组织，将肺组织经过消化分离后得到原代肺细胞；使用重编程培养基对原代肺细胞进行培养直至细胞融合度不低于80％，得到肺前体样细胞。将肺组织经过消化分离后得到原代肺细胞，使用重编程培养基对原代肺细胞进行培养直至细胞融合度不低于80％，得到肺前体样细胞，实现原代肺细胞退分化，并使得肺前体样细胞在体外快速且大量的扩增，无任何外源基因，操作安全且可靠，批次产量高，能够实现单个供体多人、多次治疗；肺前体样细胞能应用于受损肺组织的修复。织的修复。织的修复。

【技术实现步骤摘要】
肺前体样细胞的制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种肺前体样细胞的制备方法和应用。

技术介绍

[0002]肺脏是人体的重要器官，在执行呼吸任务的过程中，难免会接触外来或内在的有害物质(如大气污染、烟草、细菌病毒或血液中的毒性物质)，往往导致肺脏组织的大规模损伤，从而引发急慢性的肺损伤疾病(如呼吸窘迫综合征ARDS、慢性阻塞性肺病COPD、间质性肺病ILD、支气管扩张BE和特发性肺纤维化IPF等)。目前，对于这些疾病的治疗并无有效手段逆转疾病的进程，患者随着时间的推移，疾病逐年加重，难以治愈，最终导致死亡。
[0003]临床上针对肺组织损伤疾病如肺纤维化常用药物包括糖皮质激素、免疫抑制剂、抗凝药物等化学药物。2014年10月15日FDA批准尼达尼布(Nintedanib，商品名：Ofev)和吡非尼酮(Pirfenidone，商品名：Esbriet)两种新的口服药物用于特发性肺纤维化治疗，但均无法治愈肺纤维化，只起到延缓疾病进展的作用，治疗效果不理想且不良反应大。随着科学的发展，细胞治疗逐渐出现在大众视野里，间充质干细胞因其具有旁分泌、抗炎、免疫调节以及抗氧化等多种功能，被广泛尝试应用于多种疾病的治疗，其中包括肺纤维化和慢性阻塞性肺病。但是，间充质干细胞主要通过改变肺部炎症微环境进而促进肺的损伤修复和功能恢复，不能诱导肝组织再生，同时，间充质干细胞治疗肺损伤具有低移植率和低局部生存率的缺陷，因此间充质干细胞治疗肺纤维化等肺组织损伤的长期疗效还有待观察。
[0004]目前肺前体样细胞已被证明可以分化再生新的气道细胞和肺泡上皮细胞，重构血
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气交换单元，修复损伤肺组织，在治疗慢性阻塞性肺病、特发性肺纤维化等肺部疾病中取得了很好的疗效。同济大学的左为教授研发的自体肺前体样细胞也被应用在治疗肺纤维化疾病上。2018年研究团队成功在患者肺部支气管上皮分离出SOX9阳性的肺脏前体细胞并将其应用于临床实验中，术后3
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12个月，患者肺功能有效改善且保持良好。
[0005]但目前用于治疗肺组织损伤疾病的肺前体样细胞存在以下缺陷：
[0006]1.ESCs/iPSCs分化肺前体样细胞治疗：目前ESCs/iPSCs诱导分化治疗肺脏疾病报道较少，主要原因是干细胞体外诱导分化为肺脏细胞的培养方案仍不成熟，缺乏统一规范的标准。iPSCs有发展成畸胎瘤的风险。并且ESCs/iPSCs分化得到的肺前体样细胞，MHC二类分子表达水平高，患者需要长期系统性接受免疫抑制剂的治疗，给患者带来很多痛苦和困扰，iPSCs分化程度不纯还有致瘤的风险。
[0007]2.自体肺前体样细胞治疗：通过支气管镜从患者细支气管(3
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4级)刷取气道细胞，要求患者对这种取气道细胞的方式有较高的耐受性。当患者呼吸道症状严重时是很难耐受这种气道刮取细胞方式，因此自体肺前体样细胞在来源上受到很大的局限，同时受众群体大大缩小。
[0008]因此，有必要提供一种新型的肺前体样细胞的制备方法和应用，以实现了肺前体样细胞在体外的大量扩增，并应用于受损肺组织的修复。

技术实现思路

[0009]本专利技术的目的在于提供一种肺前体样细胞的制备方法和应用，能够实现了肺前体样细胞在体外的大量扩增，并应用于受损肺组织的修复。
[0010]为实现上述目的，本专利技术的所述肺前体样细胞的制备方法，包括以下步骤：
[0011]S1：取肺组织，将所述肺组织经过消化分离后得到原代肺细胞；
[0012]S2：使用重编程培养基对所述原代肺细胞进行培养直至细胞融合度不低于80％，得到肺前体样细胞。
[0013]所述肺前体样细胞的制备方法的有益效果在于：
[0014]将所述肺组织经过消化分离后得到原代肺细胞，使用所述重编程培养基对所述原代肺细胞进行培养直至细胞融合度不低于80％，得到肺前体样细胞，实现所述原代肺细胞退分化，并使得所述肺前体样细胞在体外快速且大量的扩增，无任何外源基因，操作安全且可靠，批次产量高，能够实现单个供体多人、多次治疗；所述肺前体样细胞能应用于受损肺组织的修复。
[0015]可选的，在所述S1中，所述肺组织的来源于不能用于移植的正常肺组织。
[0016]可选的，在所述S1中，所述肺组织经过消化分离后得到原代肺细胞的步骤包括：
[0017]S10：将所述肺组织用无菌PBS缓冲液依次进行清洗处理和消毒处理，然后将所述肺组织进行剪碎处理以得到肺组织碎块；
[0018]S11：往所述肺组织碎块中加入自配胶原酶，将所述肺组织碎块在37摄氏度下进行30分钟的孵育，得到原代肺细胞悬液；
[0019]S12：对所述原代肺细胞悬液进行筛网分选，然后收集得到肺细胞滤液；
[0020]S13：对所述肺细胞滤液进行离心处理，弃去上清，得到肺细胞沉淀物；
[0021]S14：向所述肺细胞沉淀物中加入红细胞溶解平衡液进行重悬得到肺细胞混合液，然后将所述肺细胞混合液进行离心处理，弃去上清，得到肺细胞沉淀；
[0022]S15：重复所述S14直至在所述肺细胞沉淀中观察不到红细胞为止。
[0023]可选的，在所述S10中，所述肺组织经过剪碎处理后的尺寸为1
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2mm3。
[0024]可选的，在所述S11中，以占所述自配胶原酶的体积百分比计，所述自配胶原酶的组分包括：25％
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50％的中性蛋白酶II和50％
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75％的II型胶原酶。其有益效果在于：所述自配胶原酶能使所述肺组织碎块充分的消化。
[0025]可选的，在所述S12中，对所述原代肺细胞悬液进行筛网分选时，使用的细胞滤器的孔径为60～80微米。
[0026]可选的，在所述S13中，对所述肺细胞滤液进行离心处理时，离心速率为1000rpm，离心时间为5分钟。
[0027]可选的，在所述S14中，将所述肺细胞混合液进行离心处理时，离心处理的转速为1000rpm，离心时间为5分钟。
[0028]可选的，在所述S2中，所述重编程培养基包括基础培养基、营养补充剂、生长因子、TGF
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β信号抑制剂、Wnt信号通路激活剂和ROCK激酶抑制剂。
[0029]可选的，以占所述基础培养基的体积计，所述生长因子的含量为10
‑
50纳克/毫升，所述ROCK激酶抑制剂的含量为1
‑
20微摩尔，所述Wnt信号通路激活剂的含量为1
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10微摩尔，所述TGF
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β信号抑制剂的含量为1
‑
10微摩尔，所述营养补充剂的体积含量不超过10％。
[0030]可选的，所述基础培养基为Ham
’
s F
‑
12培养基。
[0031]可选的，所述生长因子为表皮生长因子、成纤维细胞生长因子的至少一种。
[0032]可选的，所述营养补充剂包括N2、B2本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种肺前体样细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：取肺组织，将所述肺组织经过消化分离后得到原代肺细胞；S2：使用重编程培养基对所述原代肺细胞进行培养直至细胞融合度不低于80％，得到肺前体样细胞。2.根据权利要求1所述的肺前体样细胞的制备方法，其特征在于，在所述S1中，所述肺组织经过消化分离后得到原代肺细胞的步骤包括：S10：将所述肺组织用无菌PBS缓冲液依次进行清洗处理和消毒处理，然后将所述肺组织进行剪碎处理以得到肺组织碎块；S11：往所述肺组织碎块中加入自配胶原酶，将所述肺组织碎块在37摄氏度下进行30分钟的孵育，得到原代肺细胞悬液；S12：对所述原代肺细胞悬液进行筛网分选，然后收集得到肺细胞滤液；S13：对所述肺细胞滤液进行离心处理，弃去上清，得到肺细胞沉淀物；S14：向所述肺细胞沉淀物中加入红细胞溶解平衡液进行重悬得到肺细胞混合液，然后将所述肺细胞混合液进行离心处理，弃去上清，得到肺细胞沉淀；S15：重复所述S14直至在所述肺细胞沉淀中观察不到红细胞为止。3.根据权利要求2所述的肺前体样细胞的制备方法，其特征在于，在所述S11中，以占所述自配胶原酶的体积百分比计，所述自配胶原酶的组分包括：25％
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50％的中性蛋白酶II和50％
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75％的II型胶原酶。4.根据权利要求1所述的肺前体样细胞的制备方法，其特征在于，在所述S2中，所述重编程培养基包括基础培养基、营养补充剂、生长因子、TGF
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β信号抑制剂、Wnt信号通路激活剂和ROCK激酶抑制剂。5.根据权利要求4所述的肺前体样细胞的制...

【专利技术属性】
技术研发人员：周伸奥，周丽，
申请(专利权)人：上海赛立维生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：