用于检测爱媛类芽孢杆菌的引物及试剂盒和方法技术

本申请涉及用于检测爱媛类芽孢杆菌的引物及试剂盒和方法，该引物包括具有SEQ ID No.1所示核苷酸序列的引物1和具有SEQ ID No.2所示核苷酸序列的引物2。该试剂盒包括所述的引物。本申请提供一种灵敏度高、特异性好的检测引物，并进一步开发为试剂盒，通过该引物或试剂盒可实现对爱媛类芽孢杆菌的快速检测。测。

【技术实现步骤摘要】
用于检测爱媛类芽孢杆菌的引物及试剂盒和方法


[0001]本申请涉及分子生物学领域，具体涉及用于检测爱媛类芽孢杆菌的引物及试剂盒和方法。

技术介绍

[0002]爱媛类芽孢杆菌(Paenibacillus ehimensis)曾被划分为爱媛芽孢杆菌，后续根据表型、化学分型、细胞脂质和脂肪酸组成、16s rDNA序列和系统进化关系的特点将其单独划分为类芽孢杆菌属，并作为该菌属的标准菌株。爱媛类芽孢杆菌可代谢生成多种天然抗菌物质，也可介导壳寡糖的生物合成，在食品、农业、医药等领域均有较为重要的应用价值。
[0003]关于爱媛类芽孢杆菌的文献记载较少，几乎没有针对该菌的快速检测方法文献及专利报道，目前对该菌的检测和鉴定主要基于生化分析和16s rDNA测序。生化分析操作复杂、种类繁多，且无法实现菌种精确分类，16s rDNA测序分析则耗时较长。
[0004]因此，目前需要一种能够快速准确地识别检测样本中的目标菌，并实现定量分析的方法。

技术实现思路

[0005]基于此，有必要提供一种灵敏度高、特异性好的检测引物及试剂盒，实现对爱媛类芽孢杆菌的快速检测。
[0006]具体技术方案如下：
[0007]第一方面，本申请提供了一种用于检测爱媛类芽孢杆菌的引物，所述引物包括具有SEQ ID No.1所示核苷酸序列的引物1和具有SEQ ID No.2所示核苷酸序列的引物2。
[0008]第二方面，本申请提供了一种用于检测爱媛类芽孢杆菌的试剂盒，所述试剂盒包括所述的引物。
[0009]在其中一个实施例中，所述试剂盒还包括核酸扩增所用的其他试剂、阳性对照品、阴性对照品和DNA提取试剂中的至少一种。
[0010]在其中一个实施例中，所述核酸扩增所用的其他试剂包括DNA聚合酶、dNTP、PCR缓冲液和核酸染料中的一种或多种。
[0011]在其中一个实施例中，所述试剂盒满足以下至少一个或多个条件：
[0012]所述DNA提取试剂包括溶菌酶、蛋白酶K和菌体消化液；
[0013]所述阳性对照品包括爱媛类芽孢杆菌纯培养液提取的DNA；及
[0014]所述阴性对照品包括无菌去离子水。
[0015]第三方面，本申请提供了一种检测爱媛类芽孢杆菌的方法，所述方法包括如下步骤：
[0016]使用所述的引物或所述的试剂盒扩增待测样本DNA，获得Cq值，判断待测样本中是否含有爱媛类芽孢杆菌及确定其含量。
[0017]在其中一个实施例中，所述扩增方法包括实时荧光定量PCR方法。
[0018]在其中一个实施例中，所述的待测样本包括调味品样本。
[0019]在其中一个实施例中，扩增的反应体系包括DNA聚合酶、dNTP、PCR缓冲液、核酸染料、各引物和待测样本DNA。
[0020]在其中一个实施例中，扩增的程序包括：
[0021](1)预变性：95℃3min；
[0022](2)循环反应：95℃10s，65℃30s，共35～45个循环。
[0023]第四方面，本申请提供了所述的引物在制备检测爱媛类芽孢杆菌的产品中的应用。
[0024]相对于现有技术，本申请具备如下有益效果：
[0025]本申请提供了一种灵敏度高、特异性好的检测引物序列，在爱媛类芽孢杆菌中保守、稳定且结合扩增效率高，并进一步开发为试剂盒，通过该引物或试剂盒可实现爱媛类芽孢杆菌的快速、特异性检测。
[0026]进一步，本申请提供了一种用于检测待测样本中爱媛类芽孢杆菌的方法是基于上述引物及体外扩增爱媛类芽孢杆菌的特异性保守基因序列所开发的分子检测方法，可用于临床检测、食品检测、环境检测等领域。该方法具有操作简单，检测时间短，检测成本低，灵敏度高且准确性高等优点。
附图说明
[0027]图1为引物对的特异性筛选结果图；横坐标Cycles：循环数，纵坐标RFU：相对荧光强度值；
[0028]图2为引物对的稳定性和灵敏度验证筛选结果图；横坐标Cycles：循环数，纵坐标RFU：相对荧光强度值；
[0029]图3为调味品样本中引物对的特异性、稳定性和灵敏度验证筛选结果图；横坐标Cycles：循环数，纵坐标RFU：相对荧光强度值；
[0030]图4为不同菌株的实时荧光定量PCR扩增曲线；横坐标Cycles：循环数，纵坐标RFU：相对荧光强度值；
[0031]图5为不同菌浓度样本和阴性对照的实时荧光定量PCR扩增曲线；
[0032]图6为Cq值与菌量呈线性相关图；
[0033]图7为爱媛类芽孢杆菌阳性调味品样本实例检测结果图，横坐标Cycles：循环数，纵坐标RFU：相对荧光强度值。
具体实施方式
[0034]为使本申请的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本申请的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本申请。但是本申请能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本申请内涵的情况下做类似改进，因此本申请不受下面公开的具体实施例的限制。
[0035]除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的
的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本申请。
[0036]在本申请中涉及“和/或”的选择范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。
[0037]本申请中涉及“多个”、“多种”、“多次”、“多组”等，如无特别限定，指在数量上大于2或等于2。例如，“一种或多种”表示一种或大于等于两种。
[0038]在本申请中涉及“可选地”、“可选的”、“可选”，指可有可无，也即指选自“有”或“无”两种并列方案中的任一种。如果一个技术方案中出现多处“可选”，如无特别说明，且无矛盾之处或相互制约关系，则每项“可选”各自独立。本申请中，“进一步”等用于描述目的，表示内容上的差异，但并不应理解为对本申请保护范围的限制。
[0039]在本申请中以“包含”、“包括”等词语描述的开放式技术特征或技术方案中，如无其他说明，不排除所列成员之外的额外成员，可视为既提供了由所列成员构成的封闭式特征或方案，还提供了在所列成员之外还包括额外成员的开放式特征或方案。
[0040]目前爱媛类芽孢杆菌的鉴定和检测方法复杂且耗时较长，本申请针对爱媛类芽孢杆菌的特异保守基因序列设计并筛选灵敏度高、特异性好的引物，基于该引物所开发的快速检测方法能够快速准确地识别检测样本中的目标菌，并实现定量分析。
[0041]基于此，本申请一实施方式提供了一种用于检测爱媛类芽孢杆菌的引物，该引物基于爱媛类芽孢杆菌的特异保守基因序列所开发的，引物长度在18
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24bp之间，Tm值约本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测爱媛类芽孢杆菌的引物，其特征在于，所述引物包括具有SEQ ID No.1所示核苷酸序列的引物1和具有SEQ ID No.2所示核苷酸序列的引物2。2.一种用于检测爱媛类芽孢杆菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括核酸扩增所用的其他试剂、阳性对照品、阴性对照品和DNA提取试剂中的至少一种。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸扩增所用的其他试剂包括DNA聚合酶、dNTP、PCR缓冲液和核酸染料中的一种或多种。5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒满足以下至少一个或多个条件：(1)所述DNA提取试剂包括溶菌酶、蛋白酶K和菌体消化液；(2)所述阳性对照品包括爱媛类芽孢杆菌纯培养液提取的DNA；(3...

【专利技术属性】
技术研发人员：方佩，胡桂平，邓磊，李贤信，
申请(专利权)人：广东规正质量检测有限公司，
类型：发明
国别省市：