烟草铁氧化还原蛋白基因Ntab0899580及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种烟草铁氧化还原蛋白基因Ntab0899580在调控烟草株高和叶片数中的应用，降低烟草铁氧化还原蛋白基因Ntab0899580表达后，基因编辑植株株高显著降低，叶片数显著减少，成熟期叶片内的总糖还原糖含量升高，这为进一步阐明烟草铁氧化还原蛋白基因的调控机理提供了理论依据，为培育株高和叶片数显著改变的烟草品种提供了新的遗传材料。著改变的烟草品种提供了新的遗传材料。著改变的烟草品种提供了新的遗传材料。

【技术实现步骤摘要】
烟草铁氧化还原蛋白基因Ntab0899580及其应用


[0001]本专利技术属于烟草基因工程领域，具体涉及一种烟草铁氧化还原蛋白基因Ntab0899580及其在调控烟草株高和叶片数中的应用。

技术介绍

[0002]铁氧化还原蛋白广泛存在于各种植物、动物及微生物体内参与电子传递。在光合过程中，光系统接受光子，经过各个电子传递蛋白，最终将光能转化为化学能，光合型铁氧化还原蛋白作为唯一的可溶性电子受体，可将来自光系统I的电子传输到下游各种铁氧化还原蛋白依赖的代谢过程，涉及碳同化、氮同化、硫同化、叶绿素代谢、光敏色素合成、脂肪酸合成等诸多生物学途径，是光合电子向多种生物学途径分配的中枢元件，对植物的生长发育至关重要。研究发现拟南芥铁氧还蛋白——AtFd2的基因缺失突变体(Fd2
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KO突变体)在长日照与短日照培养条件下，较其野生型而言均表现出花期提前的表型，而且显示AtFd2与AtHY2在叶绿体中发生互作，并且Fd2突变体对光敏色素的反应受到抑制。
[0003]综上，对烟草中铁氧化还原蛋白的研究具有重要的理论与实践意义。为了解决以上问题，提出本专利技术。

技术实现思路

[0004]本专利技术提供了一种烟草铁氧化还原蛋白基因Ntab0899580，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0005]优选地，将所述的Ntab0899580基因的核苷酸序列进行翻译后，所得氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0006]本专利技术另一方面提供了一种第一方面所述烟草铁氧化还原蛋白基因Ntab0899580的应用，基因编辑植株成熟期叶片内的总糖、还原糖含量升高，株高显著降低，叶片数显著减少。
[0007]优选地，基因编辑是通过CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术，构建了用于敲除Ntab0899580基因的CRISPR/Cas9编辑载体，经遗传转化后获得了Ntab0899580基因发生编辑的烟草植株。
[0008]相对于现有技术，本专利技术具有以下有益效果：
[0009]本专利技术利用基因沉默技术通过敲除或者沉默Ntab0899580基因后，可以明显增加基因编辑植株新鲜烟叶中总糖还原糖含量，可以明显降低烟草株高，减少叶片数，基于此，这为进一步阐明烟草铁氧化还原蛋白基因的调控机理提供了理论依据，为培育株高和叶片数显著改变的烟草品种提供了新的遗传材料。
附图说明
[0010]图1为基因编辑植株自然株高与对照植株比较图；
[0011]图2为基因编辑植株打顶株高与对照植株比较图；
[0012]图3为基因编辑植株自然叶数与对照植株比较图；
[0013]图4为基因编辑植株有效叶数与对照植株比较图；
[0014]图5为基因编辑植株烤后烟叶总糖还原糖(左)与对照植株比较图。
具体实施方式
[0015]下面结合具体实施例对本专利技术进行说明，但本专利技术的实施方式不限于此。实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件以及手册中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件所用的通用设备、材料、试剂等，如无特殊说明,均可从商业途径得到。
[0016]实施例1
[0017]本实施例主要就烟草铁氧化还原蛋白基因Ntab0899580的获得过程，简要介绍如下。
[0018]以栽培种烟草红花大金元根为实验材料，利用RNA提取试剂盒提取烟草根部总RNA，反转录为cDNA备用：
[0019]按照植物RNA提取试剂盒说明书提取烟草总RNA。
[0020]1μg从叶片中提取总RNA用于反转录，转录体系如下：
[0021]TotalRNA1μg
[0022]Oligo(dT)(10μM)1.5μL
[0023]ddH2Oupto15μL
[0024]将上述体系混匀后置于PCR中，70℃保温5min，去除后立即置于冰上5min，之后向体系中加入以下试剂：
[0025][0026][0027]上述体系放入PCR仪中，42℃下65min，65℃下10min，4℃保温，之后置于
‑
20℃冰箱中保存使用。
[0028]通过同源比对的方法，参考拟南芥基因的序列及已知烟草部分基因序列，设计扩增引物序列如下：
[0029]F：5
’‑
TGCTCGTTGGGTTCCGTAAA
‑3’
；(SEQIDNo.3)
[0030]R：5
’‑
CCAGAAACCAACTTGCCTGC
‑3’
；(SEQIDNo.4)
[0031]以上述所制备cDNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增：
[0032]扩增体系(50μL)：
[0033][0034]混匀离心后进行PCR扩增，PCR反应条件为：95℃10sec，52℃30sec，72℃2min，共30个循环；72℃10min；25℃Hold。
[0035]对扩增产物进行提纯后测序，获得烟草铁氧化还原蛋白基因Ntab0899580序列，其碱基序列如SEQ ID No.1所示。对该基因序列进行翻译后，其所编码蛋白序列如SEQ ID No.2所示，进一步对比分析表明，该蛋白含有同源性很高的序列，高度保守。
[0036]实施例2
[0037]利用实施例1中所获得烟草铁氧化还原蛋白基因Ntab0899580，本专利技术进一步构建了CRISPR/Cas9载体，以及利用叶盘法转化获得基因编辑植株。
[0038]选择Ntab0899580基因中较特异的23nt核苷酸序列TCGACTATAAGTGTTCCTTCAGG(SEQ ID No.5)为CRISPR/Cas9的引导序列，并将该序列片段与CRISPR/Cas9载体(由西南大学提供)进行连接、转化和PCR扩增检测，PCR阳性克隆送测序公司进行测序确认，最后得到CRISPR/Cas9
‑
Ntab0899580编辑载体。
[0039]利用上一步所构建的CRISPR/Cas9
‑
Ntab0899580编辑载体质粒，以红花大金元为例，进行遗传转化和组培，以获得烟草铁氧化还原蛋白基因Ntab0899580发生敲除编辑的植株，相关实验过程简要介绍如下。
[0040]将烟草种子表面消毒后点种至MS培养基上，待长到4片子叶(15
‑
20d)，移入含MS固体培养基的培养瓶中，于25
±
1℃、光照强度30
‑
50μmol/(m2
·
s)，光照时间为16h/d条件继续培养35
‑
40d，备用。
[0041]取出
‑
80℃保存的LBA4404电转化感受态农杆菌细胞，置于冰上冻融。待感受态刚刚解冻时，加入CRISPR/Cas9
‑
Ntab0899580编辑载体质粒的2μL，混匀，置于冰上。后将混匀的感受态转移至预冷的电转杯中，将电转杯置本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.烟草铁氧化还原蛋白基因Ntab0899580，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.根据权利要求1所述的基因，其特征在于，将所述的Ntab0899580基因的核苷酸序列进行翻译后，所得氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。3.一种权利要求1
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2任一所述烟草铁氧化还原蛋白基因Ntab0899580在调控烟草株高和叶片数中的应用，...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓乐乐，杨叶昆，曾婉俐，向海英，高茜，米其利，蒋佳芮，王昆淼，张建铎，杨文武，许力，
申请(专利权)人：云南中烟工业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：