一种人类ALK-E13;A20融合基因检测用DNA标准品及其制备方法、应用技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种人类ALK

【技术实现步骤摘要】
一种人类ALK
‑
E13;A20融合基因检测用DNA标准品及其制备方法、应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种人类ALK
‑
E13；A20融合基因检测用DNA标准品及其制备方法、应用。

技术介绍

[0002]间变性淋巴瘤激酶(ALK)融合基因型肺癌已成为继表皮生长因子(EGFR)突变型肺癌之后的又一个肺癌分子亚型，具有明确的分子靶点、靶点检测技术及上市的靶向药物。
[0003]间变性淋巴瘤激酶(ALK)是最新的酪氨酸激酶靶点之一，在大约5％的NSCLC患者中被发现。ALK重排的阳性率大约为3～5％，在腺癌、从未吸烟或少量吸烟的患者中EML4
‑
ALK融合的几率更高一种。ALK是一种融合基因，属于跨膜受体酪氨酸激酶。EML4
‑
ALK融合基因定位于2号染色体的短臂上(2p21和2p23)，其5
’
端为EML4的片段，3
’
端为ALK的片段，由倒置后的EML4基因片段与残余的ALK片段连接。EML4
‑
ALK的信号转导通路为PI3
‑
K/Akt、STAT3/5、Ras
‑
MEK和PLC
‑
γ/PIP2等，这些通路与细胞存活、增殖和迁移密切相关。它已被证明在体内和体外都参与了肿瘤的发生和发展。在NSCLC中，EML4与ALK基因的融合点不同，有超过15种变异类型，其中V1(EML4 exon 13；ALK exon 20
‑
E13；A20)和V3a/V3b(EML4 exon 6ins33；ALK exon 20)是最常见的融合形式。EML4
‑
ALK基因融合可促使ALK基因引起致癌融合蛋白的表达，引起基因表达和信号的激活和失调，进而促使表达这些蛋白的肿瘤细胞增殖和存活。
[0004]2011年，美国食品和药品管理局(FDA)批准克唑替尼用于治疗间变型淋巴瘤激酶(ALK)基因重排的非小细胞肺癌。克唑替尼是一种小分子酪氨酸激酶受体抑制剂，靶向分子包括ALK、肝细胞生长因子受体(HGFR，c
‑
Met)和ROS1。EML4
‑
ALK融合基因阳性患者不能从EGFR
‑
TKI的基础治疗中受益，表现为原发耐药。而针对EML4
‑
ALK融合基因阳性的患者，使用克唑替尼等针对ALK基因的小分子抑制剂可以获得良好的临床治疗效果。因此在使用针对ALK基因的小分子抑制剂前，需进行EML4
‑
ALK融合基因突变的检测。
[0005]体外诊断试剂作为预防、诊断、治疗监测、预后观察、健康状态评价以及遗传性疾病预测的重要工具，其质量控制非常重要。体外诊断试剂标准物质对于控制体外诊断试剂产品质量、保证临床检测结果准确度，起着十分关键的作用。由于存在很多制约因素，现阶段诊断试剂国家标准物质供应尚不能完全满足注册、生产和质量控制的需要。

技术实现思路

[0006]为了解决以上问题，本专利技术的目的是提供一种人类ALK
‑
E13；A20融合基因突变检测用DNA标准品产品，该产品标准品准确度高、均匀度良好。本专利技术首次建立了人类ALK融合基因突变检测用DNA标准品产品。
[0007]本专利技术还提供了人类ALK
‑
E13；A20融合基因突变检测用DNA标准品产品的制备方法。
[0008]本专利技术为了实现上述目的所采用的技术方案为：
[0009]本专利技术提供了一种人类ALK(E13；A20)融合基因突变检测用DNA标准品，所述ALK(E13；A20)融合基因的序列(如SEQ ID NO.1所示)为：
[0010]TGACTTGCTTCTTTCACTTAGTTTTTTTTGTTTTGTTTTGTTTGTTTGTTTTTTGAGATGGAGTTTCACTCTTGTTGCCCAGGCTGGAGTGCAGTGGTCTGATTTTTAGCTTTGCATTTACTTTAAATCATGCTTCAATTAAAGACACACCTTCTTTAATCATTTTATTAGTATTTC。
[0011]本专利技术所制备的人类ALK(E13；A20)融合基因突变检测用DNA标准品，具体为：
[0012][0013]本专利技术制备的上述人类ALK(E13；A20)融合基因突变检测用DNA标准品中：具体的，
[0014]所述NCIH3122 gDNA的基因序列(如SEQ ID NO.2所示)为：
[0015]ATATAAATGGAGTCATACAATGTGTGGTCTTTTATGACTTGCTTCTTTCACTTAGTTTTTTTTGTTTTGTTTTGTTTGTTTGTTTTTTGAGATGGAGTTTCACTCTTGTTGCCCAGGCTGGAGTGCAGTGGTCTGATTTTTAGCTTTGCATTTACTTTAAATCATGCTTCAATTAAAGACACACCTTCTTTAATCATTTTATTAGTATTTCTAAGTATGATGGAAAGGTTCAGAGCTCAGGGGAGGATAT；
[0016]所述HEK293 gDNA的序列(如SEQ ID NO.3所示)为：GTGTGGTCTTTTATGACTTGCTTCTTTCACTTAGTTTTTTTTGTTTTGTTTTGTTTGTTTGTTTTTTGAGATGGAGTTTCACTCTTGTTGCCCAGGCTGGAGTGCAGTGGTGCGATTTCGGCTCACTGAACCTCCGCCTCCCAGGTTCAAGCGATTCTC。
[0017]进一步的，所述标准品测定用引物探针组为：
[0018]检测位点上游引物(如SEQ ID NO.4所示)：
[0019]5’
TTGAGATGGAGTTTCACTCTTGTTG 3
’
[0020]检测位点下游引物(如SEQ ID NO.5所示)：
[0021]5’
AAGGTGTGTCTTTAATTGAAGCATG 3
’
[0022]检测位点探针
‑
FAM(如SEQ ID NO.6所示)：
[0023]5’
AGGCTGGAGTGCAGTGGTCTGATT 3
’‑
BHQ1
[0024]内参上游引物(如SEQ ID NO.7所示)：
[0025]5’
AACCACCAGAACATTGTTCGC 3
’
[0026]内参下游引物(如SEQ ID NO.8所示)：
[0027]5’
GTCTCTCGGAGGAAGGACTTGA 3
’
[0028]内参探针
‑
VIC(如SEQ ID NO.9所示)：
[0029]5’
GCATTGGGGTGAGCCTG本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人类ALK(E13；A20)融合基因突变检测用DNA标准品，其特征在于，所述ALK(E13；A20)融合基因的序列为：TGACTTGCTTCTTTCACTTAGTTTTTTTTGTTTTGTTTTGTTTGTTTGTTTTTTGAGATGGAGTTTCACTCTTGTTGCCCAGGCTGGAGTGCAGTGGTCTGATTTTTAGCTTTGCATTTACTTTAAATCATGCTTCAATTAAAGACACACCTTCTTTAATCATTTTATTAGTATTTC。2.根据权利要求1所述的人类ALK(E13；A20)融合基因突变检测用DNA标准品，其特征在于，所述DNA标准品具体为：3.根据权利要求2所述的人类ALK(E13；A20)融合基因突变检测用DNA标准品，其特征在于，所述NCIH3122 gDNA的基因序列为：ATATAAATGGAGTCATACAATGTGTGGTCTTTTATGACTTGCTTCTTTCACTTAGTTTTTTTTGTTTTGTTTTGTTTGTTTGTTTTTTGAGATGGAGTTTCACTCTTGTTGCCCAGGCTGGAGTGCAGTGGTCTGATTTTTAGCTTTGCATTTACTTTAAATCATGCTTCAATTAAAGACACACCTTCTTTAATCATTTTATTAGTATTTCTAAGTATGATGGAAAGGTTCAGAGCTCAGGGGAGGATAT；所述HEK293 gDNA的序列为：GTGTGGTCTTTTATGACTTGCTTCTTTCACTTAGTTTTTTTTGTTTTGTTTTGTTTGTTTGTTTTTTGAGATGGAGTTTCACTCTTGTTGCCCAGGCTGGAGTGCAGTGGTGCGATTTCGGCTCACTGAACCTCCGCCTCCCAGGTTCAAGCGATTCTC。4.根据权利要求1
‑
3任一项所述的人类ALK(E13；A20)融合基因突变检测用DNA标准品，其特征在于，所述标准品测定用引物探针组为：检测位点上游引物：5
’
TTGAGATGGAGTTTCACTCTTGTTG 3
’
检测位点下游引物：5
’
AAGGTGTGTCTTTAATTGAAGCATG 3
’
检测位点探针
‑
FAM：5
’

【专利技术属性】
技术研发人员：许晓丹，段文元，杨海星，张浩，于强，冯洁，绳红丹，王晓琳，
申请(专利权)人：银丰生物工程集团有限公司，
类型：发明
国别省市：