一种全细胞催化制备去甲肾上腺素的方法技术

本发明专利技术公开了一种全细胞催化制备去甲肾上腺素的方法，利用生物转化合成的策略，在大肠杆菌胞内构建外源去甲肾上腺素的生物合成途径，以大肠杆菌作为底盘细胞，构建表达外源多巴胺

【技术实现步骤摘要】
一种全细胞催化制备去甲肾上腺素的方法


[0001]本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种全细胞催化制备去甲肾上腺素的方法
。

技术介绍

[0002]去甲肾上腺素
(Norepinephrine
或
Noradrenaline
，缩写
NE
或
NA)
即1‑
(3
，4‑
二羟苯基
)
‑2‑
氨基乙醇，属于儿茶酚胺类化合物，是一种主要由交感节后神经元和脑内肾上腺素神经末梢合成并分泌的神经递质，也是一种激素
。
去甲肾上腺素可通过影响信号传导
、
相关脑能量代谢
(
如脑灌注
、
脑氧合
、
葡萄糖和乳酸的利用
)、
调节神经炎症等多种途径来影响组成脑细胞的神经元和神经胶质细胞进而影响脑功能
。
去甲肾上腺素不仅可用作药物中间体，并且其本身就是用于抢救急性低血压和周围血管扩张导致休克的一种药物
。
[0003]去甲肾上腺素一般都是通过化学合成制备，比如
CN108069863A
公开了一种合成去甲肾上腺素的方法，以
(
‑
)
‑
二异松蒎基氯硼烷为催化剂，在醚类溶剂中于低温下利用还原剂，将去甲肾上腺素酮直接还原生成左旋去甲肾上腺素，得到含有去甲肾上腺素的溶液
。CN113717060A
公开的技术方案用3，4‑
二羟基
‑2′‑
氯苯乙酮或3，4‑
二羟基
‑2′‑
溴苯乙酮为原料，在极性非质子溶剂中与手性化合物反应后，经还原剂还原
、
催化氢化反应获得去甲肾上腺素
。
[0004]与化学合成相比，微生物转化法环境友好，过程无需高压催化剂等，污染小且产物得率高
。CN112961873A
公开了一种双酶耦合法合成去甲肾上腺素的方法，该技术方案以大肠杆菌
BL21(DE3)
为出发菌株，在胞内分别过表达了来源于哺乳动物的
L
‑
苏氨酸醛缩酶
(S
‑
TA)
基因和短乳杆菌中编码酪氨酸脱羧酶
(TDC)
基因，获得两株工程菌，将细胞破碎得到的粗酶液添加3，4‑
二羟基苯甲醛为底物，甘氨酸为辅底物，添加5‑
磷酸吡哆醛为辅因子进行反应后获得酶法转化的去甲肾上腺素
。
以上方法仍然存在步骤过程相对复杂的问题
。

技术实现思路

[0005]本专利技术目的在于克服现有技术缺陷，提供一种全细胞催化制备去甲肾上腺素的方法
。
[0006]本专利技术的技术方案如下：
[0007]一种全细胞催化制备去甲肾上腺素的方法，以重组大肠杆菌为细胞催化剂，在含有底物多巴胺的反应体系中反应，将多巴胺一步转化为去甲肾上腺素，该重组大肠杆菌表达来源于人
、
家牛
、
鸡或玉米的多巴胺
β
‑
羟化酶或来源于黑腹果蝇的酪胺
β
‑
羟化酶，该多巴胺
β
‑
羟化酶的核苷酸序列如
SEQ ID NO.01、02、03
或
04
所示，该酪胺
β
‑
羟化酶的核苷酸序列如
SEQ ID NO.05
所示
。
[0008]在本专利技术的一个优选实施方案中，所述多巴胺
β
‑
羟化酶来源于人，其氨基酸序列如
SEQ ID NO.01
所示
。
[0009]在本专利技术的一个优选实施方案中，所述重组大肠杆菌以
pTrc99A
为表达载体
。
NO.01
所示；
[0028]A、
根据来源于人的多巴胺
β
‑
羟化酶基因序列设计引物
DBH
‑
F&DBH
‑
R(
如
SEQ ID NO
：
06
和
07
所示
)
，以人的基因组
DNA
序列为模板，用引物
DBH
‑
F&DBH
‑
R
经过
PCR
扩增得到
Hs
‑
dbh
基因；该
PCR
扩增使用
Q5
高保真
DNA
聚合酶
(NEB)
，反应条件为：
98℃
预变性
5min
，
98℃
变性
28s
，
56℃
退火
40s
，
72℃
延伸
2min
，共
30
个循环；
[0029]B、
以
pTrc99A
质粒为模板，设计引物
ptrcA
‑
F1&ptrcA
‑
R1(
如
SEQ ID NO
：
08
和
09
所示
)
，
PCR
扩增得到
pTrc99A
载体片段；该
PCR
扩增使用
Q5
高保真
DNA
聚合酶
(NEB)
，反应条件为：
98℃
预变性
5min
，
98℃
变性
28s
，
56℃
退火
60s
，
72℃
延伸
3min
，共
35
个循环；
[0030]C、
将上述
Hs
‑
dbh
基因和
pTrc99A
载体片段按照浓度比
3∶1
混合
。
使用
GibsonAssembly
无缝连接技术将相连接以构建重组质粒，其反应具体条件为：
50℃
水浴孵育
30min
后置于冰上冷却；然后采用
42℃
热激法转化大肠杆菌
T1
感受态细胞
(
本实施例为
E.coli MG1655
，也可替换为
E.coli BW25113)
，经过过夜培养后挑取在含氨苄青霉素抗生素平板上生长的阳性克隆，将阳性克隆接种在
3mL
试管中本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种全细胞催化制备去甲肾上腺素的方法，其特征在于：以重组大肠杆菌为细胞催化剂，在含有底物多巴胺的反应体系中反应，将多巴胺一步转化为去甲肾上腺素，该重组大肠杆菌表达来源于人
、
家牛
、
鸡或玉米的多巴胺
β
‑
羟化酶或来源于黑腹果蝇的酪胺
β
‑
羟化酶，该多巴胺
β
‑
羟化酶的核苷酸序列如
SEQ ID NO.01、02、03
或
04
所示，该酪胺
β
‑
羟化酶的核苷酸序列如
SEQ ID NO.05
所示
。2.
如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述多巴胺
β
‑
羟化酶来源于人，其氨基酸序列如
SEQ ID NO.01
所示
。3.
如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述重组大肠杆菌以
pTrc99A
为表达载体
。4.
如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述重组大肠杆菌的底盘细胞为
E.coli MG1655
或
E.coli BW25113。5.
如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述多巴胺在所述反应体系中的浓度为
2.5
‑
3.4g/100mL
，该反应体系的溶剂为
0.1M
且
pH
＝
6.5
的
Tris
缓冲液
。6.
如权利要求5所述的方法，其特征在于：...

【专利技术属性】
技术研发人员：祁峰，黄建忠，阚乃鹏，李清晨，苏愉，
申请(专利权)人：福建师范大学，
类型：发明
国别省市：