结核分歧杆菌复合群鉴定引物组合、试剂盒、方法和系统技术方案

本发明专利技术公开了结核分歧杆菌复合群鉴定引物组合、试剂盒、方法和系统，属于微生物靶向测序技术领域。引物组合包括靶向扩增结核分枝杆菌、牛结核分枝杆菌、非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌的特异序列的引物对，还包括靶向扩增rpoB、katG、inhA、gyrA耐药位点的特异序列，人源特异序列以及内参序列的引物对。利用本发明专利技术的引物组合及方法，能靶向扩增富集样本中的结核分枝杆菌复合群的特异序列，放大阳性与阴性样本的结果差异，增加判读的可信度，对结核分枝杆菌复合群的特异性检测更为有效，其检出病原微生物的敏感度和特异性更高。物的敏感度和特异性更高。物的敏感度和特异性更高。

【技术实现步骤摘要】
结核分歧杆菌复合群鉴定引物组合、试剂盒、方法和系统


[0001]本专利技术属于微生物靶向测序
，具体地，涉及基于靶向测序技术的用于结核分歧杆菌复合群鉴定引物组合、试剂盒、方法和系统。

技术介绍

[0002]一代测序方法也被称为Sanger测序法，可通过检测核酸序列，进行生物种类的鉴定，具有准确性高、读长长等优点，缺点是通量低，测序耗时长。
[0003]二代测序方法，也称下一代高通量测序技术（Next Generation Sequencing，NGS），其可一次对几百万到十亿条DNA分子进行并行测序，是一种较一代测序通量更高、成本更低、用时更短且自动程度更高的测序技术。
[0004]在NGS的众多技术中，多重靶向测序技术通过大量针对特定基因序列的引物对待测样品中提取核酸进行多重PCR扩增，从而富集样本中目标核酸片段，再对这些目标核酸片段进行高通量测序，并对所得序列进行进生物信息分析，实现对待测样本中的目标核酸片段进行高灵敏以及高分辨率的识别。
[0005]多重靶向测序技术可以同时识别分析样本中存在的特定DNA或RNA信息，可以满足针对病原菌的特定耐药位点、耐药基因、毒力因子的检测需求。多重靶向测序技术在前期预先设定所需的病原微生物的特定引物片段，这使得多重靶向测序技术在多重PCR之后获得的片段中可以排除人源宿主以及背景细菌的干扰，同时也降低检出所需的数据量与时间。
[0006]生物信息分析技术主要利用计算算法来组装、评估、理解、可视化和归档与生物分子相关的数据，从最初的DNA序列分析到现在高通量测序技术、功能基因组学、药物靶点的筛选、引物设计都是生物信息学范畴。
[0007]多重靶向测序技术的核心技术是引物设计，生物信息学技术可通过设计特定的计算机算法，计算得到可靠特异的扩增引物，进而设计特异性引物。
[0008]经过二代测序获得的测序数据，需经过基于生物信息分析技术的算法及软件转化、过滤筛选、建库比对、归档整合，最终得到可靠可重复的分析结果。
[0009]目前临床上的结核分枝杆菌复合群及其耐药位点的一般鉴定方法如下：（一）痰涂片抗酸染色痰涂片抗酸染色可以检查是否存在结核分枝杆菌感染，分枝杆菌属于抗酸杆菌，进行染色的时候能够耐受对盐酸乙醇脱色的作用，并且能够被染成红色。对于已经感染结核分枝杆菌的患者，痰涂片抗酸染色检查，可以发现是否正在排出大量的结核分枝杆菌，判断是否是传染源。
[0010]（二）结核分枝杆菌培养及鉴定结核分枝杆菌及鉴定需要人工培养基分离、培养菌落，如果培养出结核分枝杆菌，则认为存在感染。结核分枝杆菌培养及鉴定主要用于辅助诊断是是否存在结核分枝杆菌感染，培养阳性后还可以进行药敏试验，以辅助治疗。常规的结核分枝杆菌培养需要2
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4周的时间，因为结核分枝杆菌生长缓慢，有时8周左右才有结果。培养阳性后还需4周才可以完成
药物敏感性测定。
[0011]（三）结核菌素试验结核菌素试验又称PPD试验，是指通过皮内注射结核菌素，并根据注射部位的皮肤状况诊断结核分枝杆菌感染所致Ⅳ型超敏反应的皮内试验。结核菌素试验根据在皮试后48
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72小时的皮肤的硬结大小，来判断机体有没有结核分枝杆菌感染。结核菌素试验阳性反应，说明机体曾经感染过结核分枝杆菌，或已经接种过卡介苗。
[0012]（四）Xpert MTB检测Xpert MTB检测是一种半巢式实时荧光PCR体外诊断技术，是用于结核分枝杆菌及利福平耐药快速检测产品。Xpert MTB阳性表示患者体内存在结核分枝杆菌，但不能分辨活动性与非活动性结核。Xpert MTB检测不仅可以确定是否存在结核分枝杆菌感染，还可以确定是否伴有利福平耐药性。
[0013]（五）γ
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干扰素释放试验γ
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干扰素释放实验(IGRAs)是用于诊断结核分枝杆菌感染的体外免疫学方法，IGRAs检测的基本原理为感染者体内致敏的T细胞，在体外再次接受结核特异性抗原刺激后，激活的效应T细胞能够产生抗原特异性γ干扰素（IFN
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γ），通过对IFN
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γ的检测可以反映机体是否存在结核分枝杆菌感染。
[0014]IGRAs所用的结核分枝杆菌抗原不是单一针对结核分枝杆菌的特异性抗原，IGRAs试验所用的特异性抗原ESAT
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6和CFP
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10与某些非结核分枝杆菌（如堪萨斯分枝杆菌、海分枝杆菌等）有交叉，所以当IGRAs阳性还需考虑一些NTM的感染。
[0015]有待解决的问题：（一）结核分枝杆菌复合群鉴定目前普遍采用生化试验的相关手段，大多存在时效性差或检测范围窄的问题。传统的痰涂片抗酸染色受制于痰液中的分枝杆菌数量限制，敏感性较差，漏检率高；结核分枝杆菌培养及鉴定培养时间过长，一般需要8周左右时间，时效性差；结核菌素试验无法排除卡介苗接种及大多数非结核分枝杆菌的影响；Xpert MTB检测仅能对利福平进行耐药检测，难以对其他的耐药位点（如乙胺丁醇、异烟肼等）进行检测；γ
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干扰素释放试验可以检测到某些非结核分枝杆菌，当IGRAs阳性还需考虑一些NTM的感染。目前缺少一种可以快速高效定量对结核分枝杆菌复合群及多个耐药位点进行检测的手段。
[0016]（二）对于多重靶向测序技术而言，核心在于获得高特异性引物。分枝杆菌属之间在序列上存在着相似性，低特异性的引物会扩增出同源性的序列，导致假阳性的检出。目前仍缺少设计具有高分辨率的靶向分枝杆菌复合群的引物集的方法和手段，是利用靶向测序技术鉴定结核分枝杆菌复合群的技术瓶颈。
[0017]（三）二代测序的下机数据数量庞大，内容冗杂，通过单纯的人工进行筛选比对效率低、准确性差。因此需要搭建专业的生物信息分析流程，自动化下机后的数据分析流程，使得从样品上机后的分析流程一体化，提高数据分析效率和分析过程的可追溯性。

技术实现思路

[0018]为了解决上述技术问题中的至少一个，本专利技术采用了技术方案如下：本专利技术的第一方面提供了一种结核分枝杆菌复合群鉴定引物组合，所述结核分枝
杆菌复合群包括结核分枝杆菌，牛结核分枝杆菌，非洲分枝杆菌，田鼠分枝杆菌，所述引物组合包括以下10个引物对：靶向扩增结核分枝杆菌3个特异序列的引物对：SEQ ID No.1和SEQ ID No.2组成的第1引物对，SEQ ID No.3和SEQ ID No.4组成的第2引物对，SEQ ID No.5和SEQ ID No.6组成的第3引物对，特异序列如SEQ ID No.41至SEQ ID No.43所示；靶向扩增牛结核分枝杆菌3个特异序列的引物对：SEQ ID No.7和SEQ ID No.8组成的第4引物对，SEQ ID No.9和SEQ ID No.10组成的第5引物对，SEQ ID No.11和SEQ ID No.12组成的第6引物对，特异序列如SEQ ID No.44至SEQ ID No.46所示；靶向扩增非洲分枝杆菌2个特异序列的引本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种结核分枝杆菌复合群鉴定引物组合，所述结核分枝杆菌复合群包括结核分枝杆菌，牛结核分枝杆菌，非洲分枝杆菌，田鼠分枝杆菌，其特征在于，所述引物组合包括以下10对引物对：靶向扩增结核分枝杆菌3个特异序列的引物对：SEQ ID No.1和SEQ ID No.2组成的第1引物对，SEQ ID No.3和SEQ ID No.4组成的第2引物对，SEQ ID No.5和SEQ ID No.6组成的第3引物对，特异序列如SEQ ID No.41至SEQ ID No.43所示；靶向扩增牛结核分枝杆菌3个特异序列的引物对：SEQ ID No.7和SEQ ID No.8组成的第4引物对，SEQ ID No.9和SEQ ID No.10组成的第5引物对，SEQ ID No.11和SEQ ID No.12组成的第6引物对，特异序列如SEQ ID No.44至SEQ ID No.46所示；靶向扩增非洲分枝杆菌2个特异序列的引物对：SEQ ID No.13和SEQ ID No.14组成的第7引物对，SEQ ID No.15和SEQ ID No.16组成的第8引物对，特异序列如SEQ ID No.47至SEQ ID No.48所示；靶向扩增田鼠分枝杆菌2个特异序列的引物对：SEQ ID No.17和SEQ ID No.18组成的第9引物对，SEQ ID No.19和SEQ ID No.20组成的第10引物对，特异序列如SEQ ID No.49至SEQ ID No.50所示。2.根据权利要求1所述的一种结核分枝杆菌复合群鉴定引物组合，其特征在于，所述引物组合还包括靶向扩增rpoB、katG、inhA、gyrA四个耐药基因位点特异序列的引物对：SEQ ID No.21和SEQ ID No.22组成的第11引物对，SEQ ID No.23和SEQ ID No.24组成的第12引物对，SEQ ID No.25和SEQ ID No.26组成的第13引物对，SEQ ID No.27和SEQ ID No.28组成的第14引物对，特异序列如SEQ ID No.51至SEQ ID No.54所示。3.根据权利要求2所述的一种结核分枝杆菌复合群鉴定引物组合，其特征在于，所述引物组合还包括靶向扩增人源序列的引物对：SEQ ID No.29和SEQ ID No.30组成的第15引物对、SEQ ID No.31和SEQ ID No.32组成的第16引物对，SEQ ID No.33和SEQ ID No.34组成的第17引物对，SEQ ID No.35和SEQ ID No.36组成的第18引物对，SEQ ID No.37和SEQ ID No.38组成的第19引物对，人源序列如SEQ ID No.55至SEQ ID No.59所示。4.根据权利要求3所述的一种结核分枝杆菌复合群鉴定引物组合，其特征在于：所述引物组合还包括靶向扩增内参序列的引物对：SEQ ID No.39和SEQ ID No.40组成的第2...

【专利技术属性】
技术研发人员：龚浩，杨仁涛，陈澎明，王东生，蒋华，李峰，
申请(专利权)人：美格医学检验所广州有限公司，
类型：发明
国别省市：