一种用于检测结核分枝杆菌利福平耐药基因型的方法及检测产品技术

本发明专利技术公开了一种用于检测结核分枝杆菌利福平耐药基因型的方法及检测产品。本发明专利技术提供了成套引物，包括特异PCR扩增引物组、单碱基延伸引物组1和单碱基延伸引物组2；本发明专利技术联合了PCR扩增、单碱基延伸反应和质谱检测等技术为一体，既可通过PCR技术放大检测模板，又可通过质谱技术检测微量样本，综合了两种技术的优点，远远优于单独使用PCR检测耐药基因型的方法，因此它的检测灵敏度很高。因此它的检测灵敏度很高。

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测结核分枝杆菌利福平耐药基因型的方法及检测产品


[0001]本专利技术属于医学分子生物学诊断
，涉及一种用于检测结核分枝杆菌利福平耐药基因型的方法及检测产品
。

技术介绍

[0002]结核病是全球最大的传染病杀手之一，尤其是在发展中国家
。
据
《2022
年全球结核病报告
》
估算，
2021
年，全球新发结核病患者
1060
万名，比
2020
年增加
4.5
％
。
此外，全球有
160
万人死于结核病，结核病死亡人数也较
2020
年有所增加
。
中国
2021
年估算的结核病新发患者人数为
78.0
万，在
30
个结核病高负担国家中估算结核病发病人数排第3位，占全球结核病患者总数的
7.4
％，低于印度和印度尼西亚
。
结核病耐药是目前临床上面临的主要难题之一，
2021
年新患者中利福平耐药结核病
(RR
‑
TB)
为
45
万例，耐药结核病负担增加了3％
。
利福平是最有效的结核病一线抗结核药物，
RR
‑
TB
的治疗较困难，需联合较多的抗结核药物尤其是二线抗结核药物组成化疗方案，而且疗程较长
。
>由此可见，结核病仍然是严重的公共卫生问题，利福平耐药的快速检测是有效治疗结核病的关键
。
[0003]目前，临床上开展的传统的结核分枝杆菌
(M.tuberculosis,MTB)
利福平表型药敏试验方法是建立在细菌培养基础上的，一般先在固体或液体培养基上培养细菌，细菌生长后菌种鉴定为
MTB
后再进一步进行药敏实验，一般需要1‑2个月时间，繁琐费时，严重延误结核病的早期诊断和有效化疗，导致耐药结核病的传播
。
[0004]随着分子生物学技术的发展，以及
MTB
对部分一线和二线抗结核药物耐药分子机制的部分阐明，如目前研究已经证实
MTB
利福平耐药与
RNA
多聚合酶的
β
亚单位编码基因
rpoB
突变有关，其中
90
％～
96
％的突变都发生在
rpoB 507
～
533
位密码子
(
为利福平耐药决定区域，
RRDR)
一个
81bp
的片段上，最常见的突变位点是
531
和
526
位氨基酸密码子，大多数呈现高水平耐药；而
511、513
～
516
和
521、522、529、533
位密码子突变一般导致中
、
低水平耐药；
507
～
509、517、523、532
位氨基酸置换可能与
MTB
利福平耐药无关
。
通过检测耐药相关位点的基因突变部位和突变性质，可了解患者的耐药情况，目前已建立了一系列快速检测
MTB
耐药基因型的方法，这些分子药敏试验方法是建立在基因扩增基础上的，可快速
(2
～
48h)、
灵敏地从
MTB
分离株或预处理的临床标本中检出
MTB
耐药基因突变，但目前临床应用的分子药敏试验方法各有优缺点，如反向杂交法和基因芯片方法均可了解耐药基因常见的突变位点和性质，但杂交
、
检测过程较繁琐费时，通常需1－2天时间，而且开放性检测，可能会污染扩增产物而导致假耐药的报告；实时荧光定量
PCR
和探针熔解曲线法均采用闭管检测，不会交叉污染或造成实验室污染，检测过程简便
、
快速，只需2～
3h
，但它们只能了解耐药基因是否存在突变，不报告具体的突变位点和突变类型，鉴于有些基因位点突变可能与耐药无关，而导致假阳性；耐药基因测序方法是分子药敏试验的金标准，但目前尚未在临床实验室开展，只是基因测序公司在做测序服务
。
[0005]基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱
(matrix
‑
assisted laser desorption/
ID NO:2
第
11
‑
30
位为
PCR
引物核心序列
)
组成；
[0011]所述单碱基延伸引物组1由
SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14
和具有
SEQ ID NO:16
第3‑
18
位核苷酸所示的引物组成；
[0012]所述单碱基延伸引物组2由
SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15
和
SEQ ID NO:17
所示的引物组成
。
[0013]上文所述成套引物中，所述特异
PCR
扩增引物组中各引物末端添加保护碱基；
[0014]所述特异
PCR
扩增引物组中各引物为在对应引物末端添加保护碱基；具体为在5’
端添加包括5‑
15
个碱基的保护碱基序列，优选为加入
10bp
的
tag:ACGTTGGATG。
[0015]上述特异
PCR
扩增引物组的
PCR
扩增引物可扩增区域是包含突变位点在内的一段
DNA
序列
。
所述扩增引物在3’
端具有与目的基因序列完全匹配的
15
个或以上碱基；为了避免
PCR
引物进入质谱仪检测窗口而干扰检测效果，在5’
端增加一定数目的碱基，常见如
10bp
的
tag(ACGTTGGATG)
，以使
PCR
引物的分子量增大，从而超出质谱仪检测窗口
。
[0016]所述单碱基延伸引物组中各引物末端添加接头序列；进一步地，所述接头序列优选为1‑
15
个碱基，更优选1‑3个碱基
。
[0017]上文所述的成套引物中，在一个具体实施方案中，
[0018]所述特异
PCR
扩增引物组由<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
成套引物，包括特异
PCR
扩增引物组
、
单碱基延伸引物组1和单碱基延伸引物组2；所述特异
PCR
扩增引物组由具有
SEQ ID NO:1
第
11
‑
29
位核苷酸所示引物和具有
SEQ ID NO:2
第
11
‑
30
位核苷酸所示引物组成；所述单碱基延伸引物组1由
SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14
和具有
SEQ ID NO:16
第3‑
18
位核苷酸所示的引物组成；所述单碱基延伸引物组2由
SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15
和
SEQ ID NO:17
所示的引物组成
。2.
根据权利要求1所述的成套引物，其特征在于：所述特异
PCR
扩增引物组中各引物末端添加保护碱基；所述单碱基延伸引物组中各引物末端添加接头序列
。3.
根据权利要求1或2所述的成套引物，其特征在于：所述特异
PCR
扩增引物组由
SEQ ID NO:1
所示引物和
SEQ ID NO:2
所示引物组成；所述单碱基延伸引物组1由
SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14
和
SEQ ID NO:16
所示的引物组成
。4.PCR
试剂，包括含有权利要求1‑3任一中所述特异
PCR
扩增引物组的
PCR
试剂
、
含有权利要求1‑3任一中所单碱基延伸引物组1的
PCR
试剂和含有权利要求1‑3任一中单碱基延伸引物组2的
PCR
试剂
。5.
权利要求1‑3任一所述成套引物或权利要求4所述
PCR
试剂在制备具有如下任一功能的产品中的应用；
1)
检测
MTB
中利福平耐药基因
rpoB
的突变突变位点；
2)
检测
MTB
中利福平耐药基因
rpoB
的突变突变位点的基因型；
3)
鉴定或辅助鉴定
MTB
对利福平的耐药性
。6.
一个试剂盒，包括权利要求1‑3任一所述成套引物或权利要求4所述
PCR
试剂
。7.

【专利技术属性】
技术研发人员：张俊仙，吴雪琼，张海燕，王杰，孙雯娜，梁艳，阳幼荣，马庆伟，
申请(专利权)人：北京毅新博创生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：