一种热稳定性增强的烟酰胺核糖激酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种烟酰胺核糖激酶突变体，能够应用于将NR转化为NMN。本发明专利技术构建的烟酰胺核糖激酶突变体与野生型酶相比，该突变体的热稳定性得到大幅度提升，也显著提升酶的最适反应温度，加快反应速率，提高了转化率和产物浓度，具有大规模工业应用的广泛前景。具有大规模工业应用的广泛前景。

【技术实现步骤摘要】
一种热稳定性增强的烟酰胺核糖激酶突变体及其应用

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[0001]本专利技术属于酶基因工程
，具体涉及一种新的具有强热稳定性的烟酰胺核糖激酶突变体及其应用。

技术介绍
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[0002]烟酰胺单核苷酸也叫β
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烟酰胺单核苷酸(β
‑
Nicotinamide Mononucleotide，β
‑
NMN)，结构如化合物Ⅰ所示。
[0003][0004]β
‑
烟酰胺单核苷酸在人体细胞能量生成中扮演重要角色，参与细胞内NAD
+ (烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，细胞能量转化的重要辅酶)的合成，是NAD
+
的关键前体之一。David Scinclair研究团队在文献Science,2017,355,1312
‑
1317中报道， NAD
+
在小鼠体内的增加，能够使得大龄小鼠的组织和肌肉衰老迹象被延缓，这项研究工作使得人类向实现长寿梦想迈进了一大步。NAD
+
分子量过大，口服吸收利用率低。但随着对NAD
+
前体小分子物质β
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烟酰胺单核苷酸的研究发现服用β
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烟酰胺单核苷酸可以有效提升体内NAD
+
的浓度并显著改善人体新陈代谢，使得β
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烟酰胺单核苷酸成为了“不老神药”。这也促使全球医药、食品、化妆品界科研人员不断的对β
‑
烟酰胺单核苷酸进行研究与开发。
[0005]NMN目前的生产方法有多种，其中一种就是以烟酰胺核糖为起始原料，在烟酰胺核糖激酶和ATP的作用下，一步反应得到NMN。对于酶催化反应来说，在酶的最适反应温度范围内，反应速率随着温度的升高而急剧增加，从而缩短反应时间，所以烟酰胺核糖激酶的热稳定性会限制该反应的发生。
[0006]当前，来源于人体的烟酰胺核糖激酶(NR kinase，NRK)已经被证实能够作用于NR合成NMN，而且晶体结构在2007年已经被公布到PDB数据库，登录号为2QT1。但野生型的NRK在催化过程中表现出极差的稳定性，这严重限制该酶的应用，为了提升NRK在酶催化领域的广泛应用，同时结合突变体的信息，为酶的精准改造提供大数据支持。科研人员对NRK做了改造，如专利 CN112553178A中公开一种NRK突变体，但其酶活只比野生型提高2.77倍。专利CN113832125A中公开的NRK突变体，其酶活也只比野生型提高3.06倍。
[0007]虽然现有技术中已经公开了新的NRK突变体，但是热稳定性仍然存在一定的缺陷。因此，我们仍需通过定向突变方法提高烟酰胺核糖激酶的热稳定性，将十分有助于实现工业上减少酶的用量，提高转化效率，降低生产成本。

技术实现思路
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[0008]本专利技术的目的在于针对现有技术中NRK蛋白稳定性的不足问题，利用生物学信息技术，对已经公布的蛋白质晶体结构进行数据分析，找出在蛋白质结构中柔性最大的氨基酸残基，并分析这些氨基酸在三维结构中的位置，从中选择出热点的氨基酸，对其进行定向进化，通过迭代饱和的突变技术，得到一种热稳定性显著提高的烟酰胺核糖激酶的突变体。
[0009]一方面，本专利技术提供的烟酰胺核糖激酶突变体的氨基酸序列是以SEQ IDNO.2所示的野生型烟酰胺核糖激酶为参考序列发生突变的氨基酸序列。
[0010]进一步，在蛋白质晶体结构的数据中，存在一个重要的参数温度因子，又称B
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factor，它代表着主链碳原子在平衡位置的波动幅度，它的数值成为B
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Value；根据B
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Value值的大小，选出了6个位于蛋白质表面的高柔性氨基酸Asp160、 Arg132、Thr47、Lys49、Gln135和Pro136。
[0011]更进一步，对选出的6个氨基酸进行饱和迭代突变建高通量突变库，利用高温失活后活力转化，获得高稳定性突变体。
[0012]进一步，以SEQ ID NO.2所示的野生型葡萄糖脱氢酶为参考序列发生突变的氨基酸序列Var1，突变位点为47位的苏氨酸突变为甲硫氨酸(T47M)，位点为49位的赖氨酸突变为丝氨酸(K49S)，位点为160位的天冬氨酸突变为丙氨酸(D160A)。
[0013]更进一步，所述烟酰胺核糖激酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0014]更进一步，所述烟酰胺核糖激酶突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0015]进一步，以SEQ ID NO.2所示的野生型葡萄糖脱氢酶为参考序列发生突变的氨基酸序列Var2，突变位点为132位的精氨酸突变为苏氨酸(R132T)，位点为135位的谷氨酰胺突变为亮氨酸(Q135L)，位点为160位的天冬氨酸突变为脯氨酸(D160P)。
[0016]更进一步，所述烟酰胺核糖激酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
[0017]更进一步，所述烟酰胺核糖激酶突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
[0018]进一步，以SEQ ID NO.2所示的野生型葡萄糖脱氢酶为参考序列发生突变的氨基酸序列Var3，突变位点为49位的赖氨酸突变为丝氨酸(K49S)，位点为 132位的精氨酸突变为苏氨酸(R132T)，位点为136位的脯氨酸突变为甘氨酸 (P136G)，位点为160位的天冬氨酸突变为脯氨酸(D160P)。
[0019]更进一步，所述烟酰胺核糖激酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
[0020]更进一步，所述烟酰胺核糖激酶突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。进一步，所述烟酰胺核糖激酶突变体的野生型基因序列来源于人体(Homosapiens)，野生型模板NCBI的登录号为2QT1_A。
[0021]更进一步，所述烟酰胺核糖激酶突变体表达于基因工程菌，优选大肠杆菌或酵母菌。
[0022]进一步，对上述突变体的稳定性参数进行分析，突变体Var1、Var2和Var3 的热稳定性相对于野生型烟酰胺核糖激酶有了显著提高，在30℃下的半衰期分别提升了20.3倍、20.8倍和23.5倍，最适反应温度由原来的30℃都提高到40℃。
[0023]另一方面，本专利技术提供的烟酰胺核糖激酶突变体可以应用于将NR转化为 NMN。
[0024]进一步，所述烟酰胺核糖激酶突变体为烟酰胺核糖激酶酶粉或含有该烟酰胺核糖激酶的全细胞或细胞破碎液。
[0025]本专利技术的有益效果在于，本专利技术利用蛋白质工程方法改造出一种新的烟酰胺核糖激酶突变体，该烟酰胺核糖激酶突变体的热稳定性是野生型烟酰胺核糖激酶的20倍以上，方便储存，催化效率更高，更适于工业化应用。
具体实施方式
[0026]下面结合具体实施例对本专利技术的
技术实现思路
作进一步的阐述，其目的是为了更好的理解本专利技术的内容，但本专利技术的保护范围不限于此。
[0027]实施例1 热稳定性改造的突变位本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种烟酰胺核糖激酶突变体，其特征在于，所述的烟酰胺核糖激酶突变体的氨基酸序列与氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的野生型烟酰胺核糖激酶相比，在SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第47位、第49位、第132位、第135位、第136位和第160位中的任意一个或多个位点进行单点或多点联合突变。2.如权利要求1所示的烟酰胺核糖激酶突变体，其特征在于，所述烟酰胺核糖激酶突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.3、5和7所示。3.如权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：张小飞，竺伟，
申请(专利权)人：尚科生物医药上海有限公司，
类型：发明
国别省市：