亮氨酸脱氢酶突变体及含其的基因工程菌和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种亮氨酸脱氢酶，其与出发亮氨酸脱氢酶相比，包含以下氨基酸残基差异中的一种或多种：第43位氨基酸为V和第124位氨基酸为E，且具有不低于出发亮氨酸脱氢酶的活性；其中，所述出发亮氨酸脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示或与其具有80％以上的同一性。本发明专利技术提供的亮氨酸脱氢酶的酶活比出发亮氨酸脱氢酶高，热稳定性高，并且用于催化制备L

【技术实现步骤摘要】
亮氨酸脱氢酶突变体及含其的基因工程菌和应用


[0001]本专利技术涉及生物工程
，更具体地涉及一种亮氨酸脱氢酶突变体及其编码基因、基因工程菌以及在制备L
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叔亮氨酸中的应用。

技术介绍

[0002]L
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叔亮氨酸(L
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tert
‑
leucine)分子式为C6H
13
NO2，外观为白色至近乎于白色的粉末状物质，别称L
‑2‑
氨基
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3,3
‑
二甲基丁酸，分子量131.17，是一种非天然的手性氨基酸。L
‑
叔亮氨酸是合成抗病毒药物阿扎那韦的关键侧链，抗癌药物BB
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2516、抗炎药物RO
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31
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9790、抗丙肝病毒药物特拉匹韦等药物的制备都需要借助L
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叔亮氨酸进行合成。L
‑
叔亮氨酸常常替代其他氨基酸：如缬氨酸、亮氨酸等应用于多肽合成中，L
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叔亮氨酸用作不对称反应的催化剂，在用作不对称氨化还原反应中化学酶催化剂的配体时能很好地提升其催化效率。
[0003][0004]与化学法相比，生物酶催化法是一种绿色、选择性较强的手性分子合成方法，具有较高的收率和较好的光学纯度。利用亮氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.9，leucine dehydrogenase，LeuDH)不对称合成L
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叔亮氨酸是一条比较理想的合成路径，该过程反应优势明显，反应过程以铵离子作为胺供体，原子性价比高，NADH辅酶再生系统成本低廉。
[0005]CN106906190B公开了一组亮氨酸脱氢酶用于催化制备L
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叔亮氨酸，该专利选自来源于球形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sphaericus)：CGMCC，编号1.1677的野生型亮氨酸脱氢酶(SpLeuDH)及其突变体来实验其对L
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叔亮氨酸的生物转化能力，获得最好的突变体蛋白3(氨基酸序列为该专利序列5，L40V
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G41V
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G290I)，突变体蛋白3的催化效率约为野生型亮氨酸脱氢酶的六倍，用酶标仪记录340nm处吸光值的变化，计算三甲基丙酮酸(Trimethylpyruvic acid，TMP)消耗率＝99％时的反应时间，突变体蛋白3的反应时间最短，约为野生型亮氨酸脱氢酶的57％。但是反应体系小，底物终浓度低，工业化应用有待进一步研究。
[0006]CN113106078A采用结构导向的基因挖掘技术，获得4个潜在具有高效催化高浓度三甲基丙酮酸的亮氨酸脱氢酶(LaLeuDH、BbLeuDH、TmLeuDH、LalLeuDH)，并且分别制备了重组大肠杆菌基因工程菌，发现LaLeuDH在1M TMP的反应体系中表现出最高的催化效率，并据此构建了共表达菌株E.coli BL21(DE3)/pET
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28a
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LaLeuDH
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BmGDH，在20mL的反应体系中，验证出共表达菌株冻干细胞能够在1.5M TMP、0.1M NADH下，催化反应14h后转化率>99％，
另外该专利还构建了突变体D153N/H191N的共表达菌株，在0.1mM NADH存在下，突变体D153N/H191N能够在3小时内实现>99％的转化率；在不额外添加辅酶的条件下，突变体D153N/H191N能够在18小时内将1.5M TMP转化完，但是未公开产物的光学纯度。
[0007]综上，当前国内对L
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叔亮氨酸的生物催化技术也在不断探究中，面对庞大的市场需求，亟需研发出更高效的适合工业化生产的L
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叔亮氨酸合成方法。

技术实现思路

[0008]为了解决亮氨酸脱氢酶的酶活不高，且热稳定性不强的缺陷，本专利技术提供了一种亮氨酸脱氢酶突变体及其编码基因、基因工程菌，并且应用于制备L
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叔亮氨酸。
[0009]为了克服现有技术的缺陷，本专利技术第一方面提供一种亮氨酸脱氢酶，其与出发亮氨酸脱氢酶相比，包含如下氨基酸残基差异中的一种或多种：第43位氨基酸为V和第124位氨基酸为E，且具有不低于出发亮氨酸脱氢酶的活性；其中，所述出发亮氨酸脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示或与其具有80％以上的同一性。本专利技术提供的亮氨酸脱氢酶的酶活比出发亮氨酸脱氢酶高，热稳定性高。
[0010]在一些具体实施方案中，所述出发亮氨酸脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示
[0011]在一些具体实施方案中，所述亮氨酸脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8所示。
[0012]在一些具体实施方案中，编码所述亮氨酸脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7所示。
[0013]本专利技术第二方面提供一种分离的核酸，所述核酸编码如本专利技术第一方面所述的亮氨酸脱氢酶。
[0014]在一些具体实施方案中，所述分离的核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7所示。
[0015]本专利技术第三方面提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包含如本专利技术第二方面所述的分离的核酸。
[0016]本专利技术第四方面提供一种转化体，所述转化体包含如本专利技术第二方面所述的分离的核酸或者如本专利技术第三方面所述的重组表达载体。
[0017]制备转化体所用的宿主细胞优选埃希氏大肠杆菌(Escherichia coli)，例如E.coli BL21(DE3)。
[0018]本专利技术第五方面提供一种制备如本专利技术第一方面所述的亮氨酸脱氢酶的方法，其包括：在适于表达所述亮氨酸脱氢酶的条件下培养如本专利技术第四方面所述的转化体。
[0019]本专利技术第六方面一种L
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叔亮氨酸的制备方法，其包括：
[0020]由三甲基丙酮酸与氨基供体在辅酶和如本专利技术第一方面所述的亮氨酸脱氢酶存在下，在适于所述亮氨酸脱氢酶以及辅酶作用的反应体系中进行催化反应，即得所述L
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叔亮氨酸。本专利技术提供的L
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叔亮氨酸的制备方法由于使用了更高酶活、更稳定的亮氨酸脱氢酶，所制备的L
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叔亮氨酸产量更高。
[0021]在一些具体实施方案中，所述氨基供体为NH3或含铵根离子的化合物；和/或，所述辅酶例如为NADH或NADPH。
[0022]在一些具体实施方案中，所述氨基供体为NH3或NH4Cl或NH4OAc或(NH4)2SO4；和/或，所述NADH或所述NADPH包括以下制备步骤：在用于辅酶再生的脱氢酶以及供氢体的存在下，将NAD+或NADP+进行还原反应即可。
[0023]在一些具体实施方案中，所述的用于辅酶再生的脱氢酶为葡萄糖脱氢酶、醇脱氢酶或甲酸脱氢酶；和/或，所述的供氢本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种亮氨酸脱氢酶，其特征在于，其与出发亮氨酸脱氢酶相比，包含如下氨基酸残基差异中的一种或多种：第43位氨基酸为V和第124位氨基酸为E，且具有不低于出发亮氨酸脱氢酶的活性；其中，所述出发亮氨酸脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示或与其具有80％以上的同一性。2.如权利要求1所述的亮氨酸脱氢酶，其特征在于，所述出发亮氨酸脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。3.如权利要求1或2所述的亮氨酸脱氢酶，其特征在于，所述亮氨酸脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8所示；较佳地，编码所述亮氨酸脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7所示。4.一种分离的核酸，其特征在于，所述核酸编码如权利要求1～3任一项所述的亮氨酸脱氢酶；较佳地，所述分离的核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7所示。5.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含如权利要求4所述的分离的核酸。6.一种转化体，其特征在于，所述转化体包含如权利要求4所述的分离的核酸或者如权利要求5所述的重组表达载体；制备转化体所用的宿主细胞优选埃希氏大肠杆菌(Escherichia coli)，例如E.coliBL21(DE3)。7.一种制备如权利要求1～3任一项所述的亮氨酸脱氢酶的方法，其包括：在适于表达所述亮氨酸脱氢酶的条件下培养如权利要求6所述的转化体。8.一种L
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叔亮氨酸的制备方法，其包括：由三甲基丙酮酸与氨基供体在辅酶和如权利要求1～3任一项所述的亮氨酸脱氢酶存在下，在适于所述亮氨酸脱氢酶以及辅酶作用的反应体系中进行催化反应，即得所述L
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叔亮氨酸；较佳地，所述氨基供体为NH3或含铵根离子的化合物；和/或，所述辅酶例如为NADH或NADPH；更佳地，所述氨基供体为NH3或NH4Cl或NH4OAc或(NH4)2SO4；和/或，所述NADH或所述NADPH包括以下制备步骤：在用于辅酶再生的脱...

【专利技术属性】
技术研发人员：王舒，马帅，程占冰，田振华，
申请(专利权)人：弈柯莱生物科技集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：