一种减少歪头菜镉积累的根际贪铜菌筛选方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种减少歪头菜镉积累的根际贪铜菌筛选方法及应用，所述贪铜菌菌种为由植物根际土壤中分离选育的于2023年02月24日保藏于中国典型培养物保藏中心的贪铜菌WS2，其保藏号为CCTCC NO:M 2023190。该发明专利技术针对部分地区药食两用草本植物镉污染问题，对取自重金属污染植物原生态根际土壤筛选高耐受重金属镉能力的贪铜菌菌落，通过试验研究外源施加根际细菌贪铜菌对镉污染下歪头菜生理指标的影响，发现和优化外源施加贪铜菌后歪头菜耐受重金属镉的能力，显著减轻镉暴露的毒性和歪头菜植株中镉积累，为根际细菌应用到我国西北地区歪头菜等药食两用草本的镉污染原位修复提供依据，应用前景良好。应用前景良好。

【技术实现步骤摘要】
一种减少歪头菜镉积累的根际贪铜菌筛选方法及应用


[0001]本专利技术涉及微生物相关
，具体为一种减少歪头菜镉积累的根际贪铜菌筛选方法及应用。

技术介绍

[0002]土壤的重金属污染不仅会对植物造成伤害，随着食物链逐级往上传递，在生物体内浓缩放大，最终危害人类健康，如“痛痛病”就是由于镉中毒引起的，因而对土壤的重金属污染进行修复是非常必要的，常用的土壤污染重金属修复技术主要为物理、化学手段，但是物理和化学手段往往成本较高，且容易造成二次污染，进一步影响土壤生态等。
[0003]现有如中国专利公开号为CN107815428B的一株镉去除根瘤菌KG2、含有所述根瘤菌的菌剂及其用途，应用于农田镉污染土壤的生物修复中，减少农耕土壤中的农作物对镉的富集吸收，促进重金属污染土壤中农作物得生长，以提高农作物的产量与品质，该类微生物修复技术因具有原位修复、廉价和环境友好等优点，因而逐渐受到重视。
[0004]微生物本身是土壤的重要组成部分，在污染土壤中接种微生物能够调整，植物对营养元素与重金属的吸收，而相应的不同植物不同环境下的微生物适应能力也有所区别，不同环境下的微生物治理效果也有区别，如针对我国西北地区药食两用草本植物镉污染环境下歪头菜生理指标进行试验，如何外源施加根际细菌微生物进行镉污染原位修复进一步减轻镉暴露的毒性和歪头菜植株中镉积累仍有待进一步提高，鉴于此，针对上述问题，深入研究，遂有本案产生。
[0005]针对上述问题，在原有微生物镉污染修复应用的基础上进行创新设计。

技术实现思路
<br/>[0006]本专利技术的目的在于提供一种减少歪头菜镉积累的根际贪铜菌筛选方法及应用，以解决上述
技术介绍
中提出如何外源施加根际细菌微生物进行镉污染原位修复进一步减轻镉暴露的毒性和歪头菜植株中镉积累的问题。
[0007]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种减少歪头菜镉积累的根际贪铜菌筛选方法及应用；
[0008]所述贪铜菌菌种为由重金属污染植物根际土壤中分离选育的于2023年02月24日保藏于《中国典型培养物保藏中心》的贪铜菌WS2(Cupriavidus sp.WS2)，其保藏号为CCTCC NO:M 2023190；
[0009]所述减少歪头菜镉积累的根际贪铜菌筛选方法包括如下步骤：
[0010]S1、根际土壤耐镉细菌的纯化培养；
[0011]将1g重金属污染植物根际土壤添加到9mL 0.85％无菌NaCl溶液中，并以180转/分钟的速度振荡30分钟(重复3次)。然后将混合物连续稀释，分别置于含有100μM CdCl2·
2.5H2O的LB琼脂培养基上，在30℃下培养一周。重复纯化单个耐Cd菌落以获得纯分离物。
[0012]S2、歪头菜根际细菌WS2的鉴定与筛选
[0013]使用标准分子方法提取细菌WS2总DNA，并用通用引物Uni
‑
27F和Uni
‑
1492R使用PCR扩增其16S rRNA基因序列。将PCR产物连接到pGEM
‑
Teasy载体中，并进行DNA测序，结果表明WS2属于贪铜菌属Cupriavidus。进一步测定最低抑菌浓度，将单个菌株菌落接种到含有不同浓度Cd
2+
溶液的LB培养基中，并在分析前将培养物在30℃下培养7天。抑制细菌生长的最低Cd浓度被确定为最低抑菌浓度(重复3次)。
[0014]S3、细菌去除镉的效果评价；
[0015]将菌株WS2的单菌落接种到LB培养基中，在30℃下培养过夜后，再接种到500mL初始菌体浓度OD
600
为0.1的LB培养基中。将LB培养基中的Cd
2+
浓度为1mM。将不含Cd
2+
的培养液作为对照。培养物在30℃下以180转/分钟振荡144小时，并测量菌落形成单位(CFU)以生成生长曲线。
[0016]通过测量在有或没有细菌处理的培养基中剩余的镉含量来评估镉的去除效率。取50mL培养液，在4℃下以12000转/分钟离心5分钟，取10mL上清液并稀释，然后通过0.22μm过滤器过滤。使用原子吸收光谱法(AAS
‑
6300C)测量Cd
2+
浓度。培养基中Cd的剩余比率计算为：Q＝C
×
100/C0，其中C0是初始Cd
2+
浓度(mg L
‑1)，C是滤液中的Cd
2+
浓度，mg L
‑1。
[0017]S4、歪头菜生长实验及分析；
[0018]用15mL乙醇和15mL 30％H2O2的混合物对无菌管中完全生长且均匀的歪头菜种子进行表面灭菌30分钟，并在25℃的无菌水中浸泡24小时。然后在25℃下培养种子以发芽。在25℃光照12小时和22℃黑暗12小时的条件下，在标准营养液中培育歪头菜幼苗。用单独的WS2细菌细胞(1
×
106CFU mL
‑1)、500μM Cd
2+
、WS2和Cd
2+
(WS2/Cd
2+
)分别以与上述处理相同的浓度处理均匀的培育2周的歪头菜幼苗，未经任何处理的歪头菜幼苗为对照。用于歪头菜试验的处理重复3次，每个重复包含3个花盆，每个花盆中有18个歪头菜幼苗。处理后一周，测量植物高度、生物量和光合作用速率等。用2
‑
硫代巴比妥酸(TBA)测定了歪头菜中的氧化产物之一MDA及H2O2。为了测量Cd含量，将干燥的歪头菜幼苗研磨成细粉末，并在微波炉中将样品(0.2g)在5:1(v/v)的HNO3/H2O2中消化，在4℃下以8000转/分钟离心5分钟之前，向混合物中加入10mL去离子水。在使用原子吸收光谱法(AAS
‑
6300C)测量Cd
2+
浓度之前，将上清液稀释并通过0.22μm过滤器过滤。
[0019]优选的，所述贪铜菌作为重金属污染土壤修复制剂应用，所述贪铜菌菌剂的制备方法包括以下步骤：取步骤S2中贪铜菌扩大培养的培养液，低温离心处理后去除上层清液，加入无菌水再低温离心处理后去除上层清液，重复1
‑
2次后，将离心管壁上的贪铜菌菌种用无菌水冲洗下来，配置成土壤修复制剂；
[0020]所述土壤修复制剂还包含上述营养液。
[0021]优选的，所述土壤修复制剂中菌液的浓度为106‑
108CFU ml
‑1。
[0022]优选的，所述贪铜菌菌种的保存方法为真空冷冻干燥法，且保存温度为
‑
80℃。
[0023]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：该减少歪头菜镉积累的根际贪铜菌筛选方法及应用。
[0024]1、针对我国西北地区药食两用草本植物镉污染问题，通过试验研究外源施加根际细菌贪铜菌对镉污染下歪头菜生理指标的影响，发现和优化外源施加贪铜菌后歪头菜耐受重金属镉的能力，显著减轻镉暴露的毒性和歪头菜植株中镉积累，为根本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种减少歪头菜镉积累的根际贪铜菌筛选方法，其特征在于：所述贪铜菌菌种为由植物根际土壤中分离选育的于2023年02月24日保藏于《中国典型培养物保藏中心》的贪铜菌WS2，其保藏号为CCTCC NO:M2023190；所述减少歪头菜镉积累的根际贪铜菌筛选方法包括如下步骤：S1、根际土壤耐镉细菌的纯化培养；将1g重金属污染植物根际土壤添加到9mL 0.85％无菌NaCl溶液中，并以180转/分钟的速度振荡30分钟(重复3次)；然后将混合物连续稀释，分别置于含有100μM CdCl2·
2.5H2O的LB琼脂培养基上，在30℃下培养一周；重复纯化单个耐Cd菌落以获得纯分离物；S2、歪头菜根际细菌WS2的鉴定与筛选；使用标准分子方法提取细菌WS2总DNA，并用通用引物Uni
‑
27F和Uni
‑
1492R使用PCR扩增其16S rRNA基因序列；将PCR产物连接到pGEM
‑
Teasy载体中，并进行DNA测序，结果表明WS2属于贪铜菌属Cupriavidus；进一步测定最低抑菌浓度，将单个菌株菌落接种到含有不同浓度Cd
2+
溶液的LB培养基中，并在分析前将培养物在30℃下培养7天；抑制细菌生长的最低Cd浓度被确定为最低抑菌浓度(重复3次)；S3、细菌去除镉的效果评价；将菌株WS2的单菌落接种到LB培养基中，在30℃下培养过夜后，再接种到500mL初始菌体浓度OD
600
为0.1的LB培养基中；将LB培养基中的Cd
2+
浓度为1mM；将不含Cd
2+
的培养液作为对照；培养物在30℃下以180转/分钟振荡144小时，并测量菌落形成单位(CFU)以生成生长曲线；通过测量在有或没有细菌处理的培养基中剩余的镉含量来评估镉的去除效率；取50mL培养液，在4℃下以12000转/分钟离心5分钟，取10mL上清液并稀释，然后通过0.22μm过滤器过滤；使用原子吸收光谱法(AAS
‑
6300C)测量Cd
2+
浓度；培养基中Cd的剩余比率计算为：Q＝C
×
100/C0，其中C0是初始Cd
2+
浓度(mg L
‑1)，C是滤液中的Cd
2+
浓度，mg L
‑1；S4、歪头菜生长实验及分析；用15mL乙醇和15mL 30％H2O2的混合物对无菌管中完全生长且均匀的歪头菜种子进行表面灭菌30分钟，并在25℃的无菌水中浸泡24小时；然后在25℃下培养种子以发芽；在25℃光照12小时和22℃黑暗12小时的条件下，在标准营养液中培育歪头菜幼苗；用单独的WS2细菌细胞(1
×
106CFU mL
‑1)、500μM Cd
2+
、WS2和Cd
2+
(WS2/Cd
2+
)分别以与上述处理相同的浓度处理均匀的培育2周的歪头菜幼苗，未经任何处理的歪头菜幼苗为对照；用于歪头菜试验的处理重复3次，每个重复包含3个花盆，每个花盆中有18个歪头菜幼苗；处理后一周，测量植物高度、生物量和光合作用速率等；用2
‑
硫代巴比妥酸(TBA)测定了歪头菜中的氧化产物之一MDA及H2O2；为了测量Cd含量，将干燥的歪头菜幼苗研磨成细粉末，并在微波炉中将样品(0.2g)在...

【专利技术属性】
技术研发人员：石遵计，凌宁，齐晓丽，袁学凤，受娜，付可轶，
申请(专利权)人：兰州大学，
类型：发明
国别省市：