一种集成式双酶纳米凝胶及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种集成式双酶纳米凝胶及其制备方法与应用，包括步骤：提供Hemin和生物酶；将所述氯化血红素溶解于氢氧化钠溶液中，搅拌，加入EDAC溶液、Sulfo

【技术实现步骤摘要】
一种集成式双酶纳米凝胶及其制备方法与应用


[0001]本专利技术涉及分子检测
，尤其涉及一种集成式双酶纳米凝胶及其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]集成式纳米酶是一种将多种分子催化剂或天然酶嵌入到纳米结构中的复合催化剂。在纳米尺度的受限空间内，集成式纳米酶不仅拥有更高的热稳定性和环境耐受性，也更容易实现酶级联反应，即一个酶的反应产物可以作为另一个酶的反应底物，从而提高催化效率和灵敏度。例如，Willner等人通过掺杂将辣根过氧化物酶(HRP)与葡萄糖氧化酶(GOx)嵌入到金属有机框架(MOF)，将其级联反应催化活性提升了7.5倍。在生物分析、生物传感、生物医学等领域，集成式纳米酶有着广泛的应用前景。
[0003]然而，HRP等生物酶的环境耐受性较差，容易受到温度、pH、有机溶剂等因素的影响而失活。为了解决这一问题，一些研究者使用纳米酶(如Fe3O4)或分子催化剂(如氯化血红素，Hemin)替代HRP，与GOx共同构建集成式纳米酶。其中，Hemin含有与HRP非常相似的催化活性中心(即铁卟啉)，能在宽广的环境条件下保持稳定的过氧化物酶活性。通过将Hemin与GOx嵌入到不同的纳米载体中，可以提高两者之间的空间接近性和传质效率，从而增强级联反应的灵敏度和稳定性。
[0004]目前，利用Hemin与生物酶制备集成式纳米酶的方法主要有以下几种：(1)通过共价或非共价键连接Hemin与生物酶，形成Hemin
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生物酶偶联物；(2)通过自组装或电静电吸附将Hemin与生物酶负载到金属纳米粒子或碳基纳米材料上；(3)通过掺杂或共同装配将Hemin与生物酶嵌入到金属有机框架(MOF)中。这些方法各有优缺点，例如共价连接法可以保持Hemin与生物酶的空间接近性，但可能破坏酶的活性位点；非共价连接法可以保持酶的活性，但可能导致Hemin与生物酶的分离或脱落；掺杂或共同装配法可以利用MOF的多孔结构和高比表面积提高Hemin与生物酶的负载量和分散性，但可能需要较高的合成温度或有机溶剂，且产物水溶性有待提高。
[0005]此外，Hemin催化活性明显低于HRP，也亟需利用仿生手段对其提升。一些研究者发现，通过改变Hemin的结构或周围环境，可以增强其催化活性。例如，通过引入8
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溴代
‑2′‑
脱氧鸟苷或腺苷等修饰基团，可以改变Hemin与G
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四链体之间的堆积方式和稳定性；申请人在前续专利中，通过把Hemin共价固定在聚合物纳米凝胶中，大幅度提升了其分散性及催化活性。
[0006]综上所述，基于Hemin与生物酶的集成式纳米酶的合成制备技术，应满足如下要求：(1)在温和的反应条件下进行，如室温、水相等，既满足环保要求，也避免生物酶的变性失活；(2)基于仿生手段再次提升Hemin的催化活性；(3)获得的集成式纳米酶应具有足够高的水溶性，以满足其大多数应用场景。

技术实现思路

[0007]鉴于上述现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种集成式双酶纳米凝胶及其制备方法与应用，旨在解决现有集成式纳米酶活性较低、水溶性有限的问题。
[0008]本专利技术为解决上述技术问题所采用的技术方案如下：
[0009]第一方面，本专利技术提供一种集成式双酶纳米凝胶的制备方法，其中，包括步骤：
[0010]提供氯化血红素和生物酶；
[0011]将所述氯化血红素溶解于氢氧化钠溶液中，进行第一搅拌处理，加入EDAC溶液、Sulfo
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NHS溶液，进行第二搅拌处理，加入APMA溶液，进行第三搅拌处理，得到修饰后的氯化血红素；
[0012]利用酰化反应对所述生物酶进行化学修饰，使所述生物酶携带若干个碳碳双键，得到修饰后的生物酶；
[0013]将所述修饰后的氯化血红素和所述修饰后的生物酶混合，加入聚合反应单体、交联剂、引发剂、四甲基乙二胺，进行第五搅拌处理，得到所述集成式双酶纳米凝胶。
[0014]第二方面，本专利技术提供一种集成式双酶纳米凝胶，其中，采用如本专利技术上述方案所述的制备方法制得。
[0015]第三方面，本专利技术提供一种如本专利技术上述方案所述的集成式双酶纳米凝胶在生物分子检测中的应用。
[0016]有益效果：本专利技术公开了一种集成式双酶纳米凝胶及其制备方法与应用，利用改性的分子包埋法，通过原位聚合生成的纳米凝胶共同包裹氯化血红素和生物酶，修饰后的氯化血红素在凝胶中可以充分分散，凝胶的包裹使氯化血红素和生物酶的传质距离减小，级联反应的发生让催化剂相比游离氯化血红素和生物酶活性增加数倍，显示出对底物更高的灵敏度，因此具有较好的催化活性。
附图说明
[0017]图1为本专利技术实施例1中Hem/Gox@Gel的合成示意图。
[0018]图2中(a)为Hem/Gox@Gel、Hem@Gel、Gox@Gel、Hem在300
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700nm的全谱图；(b)为Hem/Chox@Gel、Hem@Gel、Chox@Gel、Hem全谱图。
[0019]图3中(a)、(b)分别为Hem/Gox@Gel、Hem@Gel、Gox@Gel的流体力学半径和丁达尔效应；(c)为Hem/Chox@Gel、Hem@Gel、Chox@Gel、Hem流体力学半径。
[0020]图4中(a)、(b)分别为Hem/Gox@Gel的SEM和TEM图。
[0021]图5中(a)、(b)分别为NAS修饰的Gox荧光强度对比和被修饰的氨基数。
[0022]图6中(a)为Hem/Gox@Gel在葡萄糖和H2O2条件下氧化TMB的OD值变化及对照；(b)为70min时的全谱图对比；(c)为Hem/Gox@Gel加葡萄糖氧化TMB在不同时间的全谱图变化；(d)为葡萄糖、Hem/Gox@Gel、Hem/Gox@Gel+葡萄糖分别氧化TMB的颜色变化(70min)。
[0023]图7为Hem/Gox@Gel、Hem@Gel+Gox@Gel、Hem+Gox检测葡萄糖(a)OD值随时间的变化；(b)0min时的全谱图对比；(c)70min时的活性对比；(d)70min时的颜色对比。
[0024]图8为不同Hem和Gox比例下，(a)Hem/Gox@Gel检测葡萄糖的OD值变化；(b)70min时的全谱对比；(c)70min时的相对活性对比；(d)在70min的颜色对比。
[0025]图9为不同用量Hem/Gox@Gel检测葡萄糖，(a)OD值的变化；(b)在70min时的全谱对
比；(c)不同用量的相对活性；(d)不同用量Hem/Gox@Gel检测葡萄糖在70min的颜色对比。
[0026]图10中(a)为不同pH值条件下Hem/Gox@Gel检测葡萄糖的OD值变化；(b)70min时的全谱对比；(c)70min时的相对活性对比；(d)在70min的颜色对比。
[0027]图11为Hem/Gox@Gel检测不同葡萄糖浓度，(a)检测不同浓度葡萄糖的O本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种集成式双酶纳米凝胶的制备方法，其特征在于，包括步骤：提供氯化血红素和生物酶；将所述氯化血红素溶解于氢氧化钠溶液中，进行第一搅拌处理，加入EDAC溶液、Sulfo
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NHS溶液，进行第二搅拌处理，加入APMA溶液，进行第三搅拌处理，得到修饰后的氯化血红素；利用酰化反应对所述生物酶进行化学修饰，使所述生物酶携带若干个碳碳双键，得到修饰后的生物酶；将所述修饰后的氯化血红素和所述修饰后的生物酶混合，加入聚合反应单体、交联剂、引发剂、四甲基乙二胺，进行第五搅拌处理，得到所述集成式双酶纳米凝胶。2.根据权利要求1所述的集成式双酶纳米凝胶的制备方法，其特征在于，所述利用酰化反应对所述生物酶进行化学修饰，使所述生物酶携带若干个碳碳双键的步骤具体为：将所述生物酶溶解于PBS溶液中，加入NAS溶液，进行第四搅拌处理；或，将所述生物酶溶解于PBS溶液中，加入EDAC溶液和Sulfo
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NHS溶液对所述生物酶进行活化，然后加入APMA溶液，进行第四搅拌处理；其中，所述生物酶为葡萄糖氧化酶或胆固醇氧化酶。3.根据权利要求1所述的集成式双酶纳米凝胶的制备方法，其特征在于，所述氢氧化钠溶液、所述EDAC溶液、所述Sulfo
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NHS溶液、所述APMA溶液的溶剂均为去离子水；所述氢氧化钠溶液的浓度为(0.01～0.03)M，所述EDAC溶液的浓度为(150～250)mM，所述Sulfo
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NHS溶液的浓度为(18～22)mM，所述APMA溶液的浓度为(3～7)mg/mL。4.根据权利要求3所述的集成式双酶纳米凝胶的制备方法，其特征在于，所述氯化血红素、所述氢氧化钠溶液、所述EDAC溶液、所述Sulfo
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NHS溶液、所述APMA溶液的质量体积比为1mg：(0.5～1.5)mL：(80～120)μL：(80～120)μL：(80～120)μL。5.根据权利要求1所述的集成式双酶纳米凝胶的制备方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈彦涛，吴武高，崔家晴，曾金燕，
申请(专利权)人：深圳大学，
类型：发明
国别省市：