向性修饰的重组病毒载体及其用于将遗传材料靶向引入人细胞内的用途制造技术

本文提供的是用于用多特异性结合分子例如双特异性抗体，例如在体内重靶向重组病毒衣壳蛋白

【技术实现步骤摘要】
向性修饰的重组病毒载体及其用于将遗传材料靶向引入人细胞内的用途
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请是申请号为
201880042990.1、
申请日为
2018
年
06
月
27
日
、
专利技术名称为“向性修饰的重组病毒载体及其用于将遗传材料靶向引入人细胞内的用途”的中国专利技术专利申请的分案申请，原申请为
PCT/US2018/039874
的国家阶段申请，该国际申请要求于
2017
年
06
月
27
日提交的美国临时申请序列号
62/525,704
的优先权和权益
。


[0003]本文的公开内容总体上涉及向性修饰的重组病毒载体，以及包含其的组合物，其可用于将遗传材料靶向引入细胞和
/
或组织内
。

技术介绍

[0004]将基因递送到特定的靶细胞已成为现代医学中用于诊断和治疗各种慢性疾病和遗传疾病的最重要技术之一
。
迄今为止，基因治疗在临床应用中的进展已受到缺乏理想的基因递送媒介物的限制
。
为了达到治疗成功，基因递送媒介物必须能够转导靶细胞，同时避免非靶细胞的转导
。
具体地，当病毒的天然向性不能满足即时治疗需要时，需要其中天然向性被消除或缩小并且成功地改造了所需向性的重组病毒载体
。(Buchholz
等人
)<br/>[0005]近年来，在载体开发中的大多数进展已使用以下来达到：裸露病毒
(
例如，包含由不含衣壳的病毒衣壳蛋白形成的衣壳的病毒
(
例如，脂质双层
))
，例如腺相关病毒
(AAV)
和腺病毒
(Ad)
，以及有包膜病毒
(
例如，关于其衣壳被脂质双层包围的病毒
)
，例如逆转录病毒
、
慢病毒和单纯疱疹病毒
。
基于
AAV
的载体已成为许多研究的重点，因为
AAV
是无包膜病毒，其仅为轻度免疫原性的，但能够在体内转导广泛范围的物种和组织，而无毒性的证据
。
[0006]AAV
是小的
、
无包膜的
、
单链
DNA
病毒
。AAV
基因组为
4.7kb
，并且特征在于两个反向末端重复
(ITR)
，以及分别编码
Rep
蛋白和
Cap
蛋白的两个开放读码框
。
这两个
ITR
是
AAV
复制
、
包装和整合所必需的唯一顺式元件
。Rep
读码框编码分子量为
78kD、68kD、52kD
和
40kD
的四种蛋白质
。
这些蛋白质主要在调节
AAV
复制和
AAV
整合到宿主细胞的染色体内起作用
。Cap
读码框编码分子量为
83
‑
85kD(VP1)、72
‑
73kD(VP2)
和
61
‑
62kD(VP3)
的三种结构
(
衣壳
)
病毒蛋白
(VP)。AAV
病毒粒子中超过
80
％的总蛋白质包含
VP3
；在成熟病毒粒子中，
VP1、VP2
和
VP3
以大约
1:1:10
的相对丰度发现
。
在体外，这三种蛋白质自发地组装成病毒体样结构，例如病毒衣壳
。
因此，看起来受感染细胞中病毒衣壳的形成不依赖于病毒
DNA
合成进行
(
由
Kotin
等人
(1994)Hum.Gene Ther.5:793
综述
)。
[0007]在所有已知的
AAV
血清型中，
AAV2
可能是最充分表征的血清型，因为它的感染性克隆是首个制备的
。(Samulski
等人
(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79:2077
‑
2081)。
随后，还确定了
AAV3A、AAV3B、AAV4
和
AAV6
的完整序列
。(Rutledge
等人
(1998)J.Virol.72:309
‑
319
；
Chiorini
等人
(1997)J.Virol.71:6823
‑
6833
；
S.Muramatsu
等人
(1996)Virol.221:208
‑
217)。
一般地，所有
AAV
在核苷酸序列上共享超过
80
％的同一性
。
[0008]AAV
是用于人基因治疗的有希望的载体，因为与其它病毒载体不同，
AAV
并未显示与任何已知的人疾病相关，并且一般不被视为致病性的
。(Muzyczka
等人
(1992)Current Topics in Microbiology and Immunology158:97
‑
129)。
此外，
AAV
安全地以相对低的免疫原性转导有丝分裂后组织，并且如果
Rep
蛋白以反式形式供应，则能够以位点特异性方式整合到宿主染色体内，并且整合到组织培养细胞中
19
号染色体内
。(Kotin
等人
(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2211
‑
2215
；
Samulski
等人
(1991)EMBO J.10(12):3941
‑
3950
；
Balague
等人
(1997)J.Virol.71:3299
‑
3306
；
Surosky
等人
(1997)J.Virol.71:7951
‑
7959)。AAV
的整合基因组已显示允许在许多组织中的长期基因表达，所述组织包括肌肉
、
肝和大脑
(Fisher(1997)Nature Med.3(3):306
‑
312
；
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种组合物，其包含
(i)
重组腺相关病毒
(AAV)
载体，其包含封装目的核苷酸的
AAV
衣壳，其中所述
AAV
衣壳包含经修饰以包含异源表位的重组
AAV
衣壳蛋白，其中所述重组
AAV
衣壳蛋白衍生自经修饰以表达所述异源表位的
AAV
衣壳基因；
(ii)
多特异性结合分子，其包含
(a)
特异性结合所述异源表位的抗体互补位，并且
(b)
特异性结合细胞表面蛋白或标志物的重靶向配体；和任选地
(iii)
药学可接受的载体
,
其中所述
AAV
衣壳显示出
:
‑
在不存在所述多特异性结合分子时，减少至消除的向性；和
‑
在与所述多特异性结合分子组合时，与参考
AAV
衣壳相比，改变的向性，其中所述参考
AAV
衣壳包含参考
AAV
衣壳蛋白，其与所述重组
AAV
衣壳蛋白等同但缺乏所述异源表位
。2.
根据权利要求1所述的组合物，其中所述重组
AAV
衣壳蛋白还包含除了所述异源表位之外的突变
。3.
根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述异源表位被插入，以使得与缺乏所述异源表位的参考
AAV
衣壳相比，所述插入部分地减少了所述
AAV
衣壳的向性，并且所述
AAV
衣壳蛋白还包含除了所述异源表位的插入之外的突变
(
例如，取代
、
缺失
、
除了所述异源表位的插入之外的插入
)
，与缺乏所述突变的参考
AAV
衣壳相比，所述突变进一步减少和
/
或消除所述重组
AAV
衣壳的向性
。4.
根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中在与所述多特异性结合分子组合时所述改变的向性是指与所述参考
AAV
衣壳的向性相比，所述
AAV
衣壳的向性恢复且重定向
。5.
根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中
(i)
所述异源表位包含亲和标签和任选的接头，和
/
或
(ii)
所述重组
AAV
衣壳蛋白包含氨基酸序列
EQKLISEEDL(
如
SEQ ID NO:6
所示
)
，其中所述氨基酸序列
EQKLISEEDL
侧翼为和
/
或可操作地连接至
AAV
衣壳蛋白的至少5个邻接氨基酸
。6.
根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述异源表位包含氨基酸序列
EQKLISEEDL(SEQ ID NO:6)
或其部分，并且其中所述抗体互补位特异性结合至所述氨基酸序列
EQKLISEEDL
或其部分
。7.
根据权利要求1所述的组合物，其中所述目的核苷酸是：
(i)
处于选自由病毒启动子
、
细菌启动子
、
哺乳动物启动子
、
禽类启动子
、
鱼类启动子
、
昆虫启动子及其任何组合组成的组的启动子的控制下，任选地其中所述目的核苷酸处于非人启动子的控制下；或
(ii)
处于非人启动子的控制下并且侧翼为
AAV ITR
序列；或
(iii)
报道基因，任选地，其中所述报道基因编码绿色荧光蛋白，或选自由自杀基因
、
编码抗体或其片段的核苷酸
、
编码
CRISPR/Cas
系统或其部分的核苷酸
、
编码反义
RNA
的核苷酸
、
编码
siRNA
的核苷酸及其组合组成的组
。
8.
根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述多特异性结合分子是双特异性结合分子
。9.
根据权利要求1所述的组合物，其中所述抗体互补位是
Fv
结构域，任选地其中所述
Fv
结构域直接融合至重链恒定结构域
。10.
根据权利要求1所述的组合物，所述重靶向配体是抗体或其部分，任选地：其中所述抗体是双特异性抗体，其中所述抗体互补位和所述重靶向配体各自包含与第一重链恒定结构域和第二重链恒定结构域融合的不同的
Fv
结构域，任选地其中所述第一重链和第二重链以不同的结合亲和力与蛋白
A
结合；或其中所述重靶向配体包含四聚体抗体结构，所述四聚体抗体结构包含两条等同的免疫球蛋白重链和两条等同的轻链，并且其中结合所述异源表位的所述抗体互补位附加至一条或两条重链的
C
末端或
N
末端和
/
或附加至一条或两条重链的
C
末端或
N
末端，并且任选地其中所述抗体互补位是
scFv
，任选地其中所述
scFv
包含如
SEQ ID NO:37
所示的氨基酸序列
。11.
根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述细胞表面蛋白是受体，和
/
或其中所述重靶向配体与在哺乳动物或人细胞表面上表达的受体相结合
。12.
根据前述权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：C，
申请(专利权)人：瑞泽恩制药公司，
类型：发明
国别省市：