一种基于dCas9的沙门氏菌检测核酸扩增方法试纸条制备及其应用技术

本发明专利技术涉及食品安全技术领域，具体为一种食品样品中沙门氏菌的快速检测方法，具体名称为一种基于dCas9的沙门氏菌检测核酸扩增方法、试纸条制备及其应用，所述针对沙门氏菌的引物组分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。所述dCas9包括dCas9蛋白和sgRNA，所述sgRNA序列如SEQ ID NO.7所示。所述金探针序列如SEQ ID NO.8所示，所述侧向流层析技术包括支撑板，所述支撑板的上端面包括依次设置的上样区、划线区及吸水区，所述划线区内设置结合链霉亲和素的检测线T和捕获探针的质控线C，所述捕获探针序列如SEQ ID NO.9所示。本发明专利技术的检测方法特异性好，灵敏度高，重复性好，操作简单，适用性强，且整个检测流程可在40min内完成。成。成。

【技术实现步骤摘要】
一种基于dCas9的沙门氏菌检测核酸扩增方法试纸条制备及其应用


[0001]本专利技术涉及食品安全
，具体为一种基于dCas9的沙门氏菌检测核酸扩增方法试纸条制备及其应用。

技术介绍

[0002]沙门氏菌属肠杆菌科，有2000多种血清型，为革兰氏染色阴性杆菌，绝大多数有鞭毛并能运动。菌体溶解时，其细胞壁所含的脂多糖释放出来，形成内毒素。食品中含有多种丰富的营养成分，非常适宜于沙门氏菌的生长繁殖，人们一旦摄入了含有大量沙门氏菌的食品，就会引起细菌性感染，进而在毒素的作用下发生食物中毒，严重者甚至导致死亡。由沙门氏菌引起的细菌性食物中毒在世界各国居于首位。此外，沙门氏菌不仅危害人类健康还会给畜牧业带来巨大经济损失。因此综上考虑，开发一种快速、可靠、方便检测食品中沙门氏菌的方法具有重大的意义。
[0003]当前已开发的用于检测食品中沙门氏菌的方法有很多，根据现有资料的统计，主要有三类检测方法：传统培养法、免疫学方法以及分子生物学方法。但是这些方法都存在缺点。例如传统培养法检测结果直观、准确且灵敏度很高。但是整个流程需要专业人员在特定环境下进行，工作量大，要求较高，且微生物培养法检测周期普遍较长，影响突发食品中毒事件后的处理，无法满足现场快速检测的要求。免疫学方法的原理是抗原的靶点与抗体的可用表位特异性结合。虽然具有灵敏度高、特异性强的优点，但是免疫学检测的灵敏度和特异性易受抗体吸附能力、抗体特异性以及基质背景干扰等因素的影响，无法满足实际情况中食源性致病菌的快速检测需求。随着生物检测技术的发展，目前已开发出基于分子水平的食源性致病菌快速检测技术。分子检测技术是一种基于DNA或RNA，用分子生物学方法对食品中致病菌进行检测的方法。其中，以PCR技术为代表的传统核酸扩增技术可以短时间内在生物体外扩增目标DNA片段，具有操作简单、灵敏度高的特点，但是需要的PCR仪器价格昂贵，难以应用到室外检测中。另一方面，近年来快速发展的等温扩增技术收到科研人员越来越多的关注并且已经取得了重大成就，等温扩增技术具有较高灵敏度和特异性的同时，不需要升温与降温的循环过程，操作更简便，但也会受到非特异性扩增的干扰而产生假阳性结果。另一方面，规律成簇的间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)快速发展，成为新一代的基因编辑技术。CRISPR技术因具有操作简单、编辑效率高等优势，已广泛运用于基因育种、新药研发、疾病治疗、细菌检测等领域，被称为第三代基因编辑技术。科研人员考虑将核酸扩增与CRISPR技术相结合开发出新型检测方法，其中Cas12在分析诊断领域等领域拥有较大潜力，但它处于比Cas9更早的发展阶段，可能缺乏精确基因组编辑所需的一些准确性，例如Cas12系统在检测并切割特定的目标DNA序列时，由于其本身具有单链DNA的非特异性切割活性，可能会干扰检测结果，并且与之相比，Cas9系统的sgRNA序列更容易设计，因此采用Cas9系统取得的效果可能更佳。CRISPR/Cas9系统除了基础的通过双链断裂来进行基因编辑外，经过改造和修饰后，其
还开发了更多的用途，如使Cas蛋白的核酸切割部位失活后，Cas蛋白到目标位点附近后就不会进行核酸的切割，最终形成无活性的Cas9蛋白，即dCas9蛋白。与Cas9不同的是，dCas9由于HVH、RuvC核酸酶失活而不具有切割活性，但其sgRNA仍然对于目标DNA具有较强的特异性结合活性。在核酸扩增的后端加入dCas9蛋白在提升检测性能方面具有较大潜力。
[0004]综上考虑，开发一种简单、方便、灵敏且准确的沙门氏菌检测方法，对于资源有限的地区食品安全事故的预防与应急处理具有重要的意义。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种基于dCas9的沙门氏菌检测核酸扩增方法试纸条制备及其应用，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。
[0006]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种基于dCas9的沙门氏菌检测核酸扩增方法、试纸条制备及其应用，其步骤包括：
[0007]S1：将含有沙门氏菌的食品样品与提取液混合后加热裂解一段时间，获得含有沙门氏菌DNA的溶液；
[0008]S2：采用针对沙门氏菌的引物组，在恒定温度下进行LAMP扩增一段时间，获得生物素功能化的LAMP产物；
[0009]S3：将适量dCas9蛋白、sgRNA、金纳米粒子
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金探针偶联物和LAMP产物在上样缓冲溶液中混合，并孵育一段时间，将复合物加入侧向流层析试纸条的检测区进行检测，根据检测线的显色结果实现待测食品样品中沙门氏菌的定性或定量检测。
[0010]优选的技术方案中，所述提取液包含氯化镁、EDTA、Tris
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HCl、十二烷基硫酸三乙醇胺、氯化钾和水杨酸甲酯，其中，所述十二烷基硫酸三乙醇胺质量体积分数为8％
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12.5％，所述氯化钾浓度为2.5
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3.2mol/L；
[0011]优选的技术方案中，所述引物组包括有第一引物、第二引物、第三引物、第四引物、第五引物、第六引物，所述第一引物、第二引物、第三引物、第四引物、第五引物、第六引物的序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示，所述第六引物的5
’
端用生物素标记。
[0012]优选的技术方案中，所述LAMP扩增的引物组浓度为20
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500nmol/L；所述LAMP扩增的恒定温度为58
‑
65℃；所述LAMP扩增的时间为25
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40min；
[0013]优选的技术方案中，所述dCas9的浓度为20
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500nmol/L；
[0014]所述sgRNA浓度为20
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500nmol/L；所述sgRNA序列如SEQ ID NO.7所示；
[0015]所述金纳米粒子为15
‑
40nm；所述金探针的序列如SEQ ID NO.8所示。
[0016]所述金纳米粒子
‑
金探针偶联物的制备方法，包括以下步骤：
[0017]A1：将10μL金探针(10μM)，2μL TCEP溶液(1mM)和1μL乙酸缓冲液(500mM，pH 5.2)混合，避光孵育1h。同时在1.5mL离心管中加入1mL金纳米粒子，在8500rpm离心10min后去上清备用。
[0018]A2：将活化的金探针加入100μL 10倍浓缩的金纳米粒子中，孵育1h。
[0019]A3：加入2μL 10％ BSA溶液室温孵育1h。
[0020]A4：在8500rpm离心10min去除过量的金探针。获得的金纳米粒子
‑
金探针偶联物用100μL重悬液(1mM Tris
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于dCas9的沙门氏菌检测核酸扩增方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：S1：将含有沙门氏菌的食品样品与提取液混合后加热裂解，获得含沙门氏菌DNA的溶液；S2：采用针对沙门氏菌的引物组，在恒定温度下进行LAMP扩增一段时间，获得生物素功能化的LAMP产物；S3：将适量dCas9蛋白、sgRNA、金纳米粒子
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金探针偶联物和LAMP产物在上样缓冲溶液中混合，并孵育一段时间，将复合物加入侧向流层析试纸条的检测区进行检测，根据检测线的显色结果实现待测食品样品中沙门氏菌的定性或定量检测。2.根据权利要求1所述的一种基于dCas9的沙门氏菌检测核酸扩增方法，其特征在于：提取液包含氯化镁、EDTA、Tris
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HCl、十二烷基硫酸三乙醇胺、氯化钾和水杨酸甲酯，其中，所述十二烷基硫酸三乙醇胺质量体积分数为8％
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12.5％，所述氯化钾浓度为2.5
‑
3.2mol/L。3.根据权利要求1所述的一种基于dCas9的沙门氏菌检测核酸扩增方法，其特征在于：所述引物组包括有第一引物、第二引物、第三引物、第四引物、第五引物、第六引物，所述第一引物、第二引物、第三引物、第四引物、第五引物、第六引物的序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示，所述第六引物的5
’
端用生物素标记。4.根据权利要求1所述的一种基于dCas9的沙门氏菌检测核酸扩增方法，其特征在于：所述LAMP扩增的引物组浓度为20
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500nmol/L，所述LAMP扩增的恒定温度为58
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65℃，所述LAMP扩增的时间为25
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40min，所述dCas9的浓度为20
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500nmol/L，所述sgRNA的序列如SEQ ID NO.7所示，所述sgRNA浓度为20
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500nmol/L。5.根据权利要求1所述的一种基于dCas9的沙门氏菌检测核酸扩增方法，其特征在于：所述金纳米粒子
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金探针偶联物中金纳米粒子为15
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40nm，所述金探针的序列如SEQ ID NO.8所示，所述金纳米粒子
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金探针偶联物的制备方法包括有以下步骤：A1：将10μL浓度为10μM的金探针、2μL浓度为1mM的TCEP溶液和1μL浓度为500mM且pH为5.2的乙酸缓冲液混合，避光孵育1h，同时在1.5mL离心管中加入1mL金纳米粒子，在8500rpm离心10min后去上清备用；A2：将活化的金探针加入100μ...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦盼柱，江翰，
申请(专利权)人：安徽医科大学，
类型：发明
国别省市：