本发明专利技术公开了ＦＭＵ－ＥＰＣＡＭ－２Ｄ７单克隆抗体的轻链和重链可变区，ＦＭＵ－ＥＰＣＡＭ－２Ｄ７单克隆抗体轻链可变区的氨基酸序列如ＳＥＱ?ＩＤ?ＮＯ．１，重链可变区的氨基酸序列如ＳＥＱ?ＩＤ?ＮＯ．２所示。本发明专利技术通过重组人ＥＰＣＡＭ免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，制备了一组小鼠抗人ＥＰＣＡＭ单克隆抗体，筛选出能稳定分泌高亲和力抗人ＥＰＣＡＭ单克隆抗体的杂交瘤细胞株，制备腹水，获得高亲和力的抗人ＥＰＣＡＭ单克隆抗体。确认该基因序列和相应蛋白序列的唯一性及其ＣＤＲ序列；为抗人ＥＰＣＡＭ嵌合或人源化基因工程抗体提供支持。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医学
，涉及一种单克隆抗体，特别涉及一种抗人EPCAM 的FMU-EPCAM-2D7单克隆抗体的轻链和重链可变区，包括其氨基酸序列和核苷酸序列。
技术介绍
上皮细胞黏附分子(EPCAM)最初是作为结肠癌的优势表位被发现，当时认为其作 用是细胞黏附和治疗用抗体的可靠结合位点。目前研究认为，EPCAM是糖基化的I型跨膜 糖蛋白，分子量为30到40kD，其结构包括有一个表皮生长因子样和一个甲状腺球蛋白样的 胞膜外区，一段跨膜区和一段26个氨基酸的胞浆区。在正常细胞中EPCAM主要位于上皮细 胞间隙的紧密连接处。由EPCAM表达的强度和频率显示，其基本上高表达于所有人类腺癌、 部分鳞状细胞癌、视网膜母细胞瘤和肝细胞癌。2007年以前对EPCAM功能方面的研究发现EPCAM在细胞增殖、迁移和信号转导中 具有重要作用。例如EPCAM在人和啮鼠动物细胞的增强表达，增强了细胞锚定和血清生长 因子非依赖的增殖，并且增加了如c-myc和cyclins在内的各种靶基因的表达；在乳腺癌细 胞系，EPCAM信号经RNA干涉，可造成细胞增殖、迁移和侵袭能力的降低。最近的研究证实=EPCAM可以作为一些实体肿瘤干细胞的表面标志物之一，也可 以作为正常干细胞表面标志物的组成部分。同时，研究结果还很好地解释了 EPCAM在肿瘤 细胞高表达的原因，并且发现其与一些肿瘤患者预后较差和生存率较低有关；并进一步解 释了 EPCAM与肿瘤的关系。此外，小鼠胚胎干细胞实验证实，EPCAM在肿瘤干细胞、正常干 细胞上的高表达和其自身正反馈的上调，对确保维持这些正常干细胞及以恶性干细胞的增 殖非常重要。抗EPCAM抗体用于肿瘤治疗的研究一直是抗体治疗研究的热点。早在1979年开 发的鼠源性抗EPCAM抗体17-1A，于1982年就用于对肿瘤的临床治疗。但是鼠源性抗体药 物在人体使用时，由于其具有免疫原性，会引起人体的免疫反应，从而造成对抗体药物的清 除或免疫复合物介导的超敏反应。对鼠源性抗体基因改造可以部分解决其免疫原性问题， 如构建嵌合抗体或人源化抗体等。抗体单体分子是由两条相同的重链(H链)和两条相同的轻链(L链)，通过链间二 硫键连接而成的四肽链结构。H链和L链包括氨基(N)端和羧基(C)端，靠近N端的可变区 (V区)由高变区/互补决定区(HVR/CDR)和骨架区(FR)组成；靠近C端为恒定区(C区)。 重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)形成的蛋白质折叠是抗原结合部位，其中的CDR/HVR 是抗体与抗原决定基互补结合的部位，C区引发抗原抗体识别后的反应。抗体根据FR/C区 不同可分为人源、鼠源等，鼠源性抗体在人体内使用时具有免疫原性，易引起人体的免疫反 应，这些免疫反应可引起对鼠源性抗体的清除以及免疫复合物介导的超敏反应。为了克服 鼠源性抗体的缺陷，需要构建高亲和力的特异性嵌合抗体、单链抗体或人源化抗体。在改造过程中，最为重要的是首先必须获得具有良好特异性和亲和力鼠源性亲本 抗体，克隆其轻链和重链可变区基因，然后将这两条基因进行改造，构建重组抗体基因。针3对这些问题，抗EPCAM治疗性抗体的研发不断取得进展，抗EPCAM的大鼠和小鼠双特异性抗 体Catumaxomab，单链抗体Proxinium，人源化抗体ING-I，人源化融合抗体EMD和完全人源 化抗体Adecatumumab (MT201)等先后进入临床治疗肿瘤的研究。目前在临床试验中，通过 改造的抗体Adecatumumab治疗乳腺癌取得了良好的效果。因此，筛选出高亲和力鼠源性抗 人EPCAM单克隆抗体，从中克隆出轻、重链可变区基因，对进一步改善以EPCAM为靶点的药 物制备和对肿瘤的治疗具有非常重要的意义。
技术实现思路
本专利技术解决的问题在于提供一种抗人EPCAM的FMU-EPCAM-2D7单克隆抗体的轻链 和重链可变区，包括其氨基酸和核苷酸序列，为构建高亲和力的抗EPCAM嵌合或人源化基 因工程抗体提供支持。本专利技术是通过以下技术方案来实现FMU-EPCAM-2D7单克隆抗体的轻链和重链可变区，所述轻链可变区的3个互补决 定区(CDR)序列分别为CDRl :Gln-Asn-Leu-Leu-Asp-Ser-Asp-Gly-Lys-Thr-Tyr ；CDR2 =Val-Val-Ser-Lys-Leu-Asp-Ser ；CDR3 =Trp-Gln-Gly-Thr-His-Phe-Pro-Trp-Thr ；重链可变区的3个互补决定区(OTR)序列分别为CDRl.Gly-Tyr-Ser-Phe-Tyr-Ser-Tyr-Trp ；CDR2 Jle-Tyr-Pro-Gly-Asn-Ser-Val-Thr ；CDR3 :Ile-Arg-Gly-Gly-Asn-Tyr。所述的单克隆抗体轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1，重链可变区的氨基 酸序列如SEQ ID NO. 2所示。所述的编码单克隆抗体轻链可变区的基因序列如SEQ ID NO. 3所示，编码重链可 变区的基因序列如SEQ ID N0. 4所示。所述的单克隆抗体应用于以人EPCAM为靶点的基因工程抗体或诊断试剂的制备。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益的技术效果1、本专利技术提供的FMU-EPCAM-2D7单克隆抗体是一种抗人EPCAM的高亲和力单克 隆抗体，经过间接ELISA检测、流式细胞仪检测证实该单克隆抗体能够特异性地结合人 EPCAM ；2、克隆该单克隆抗体轻链、重链可变区基因和氨基酸序列，序列分析证实了该抗 体序列的惟一性。3、分析获得轻链、重链可变区的⑶R区，在此基础上为构建高亲和力的抗人EPCAM 嵌合或人源化基因工程抗体提供支持。附图说明图1是抗人EPCAM的FMU-EPCAM-2D7单克隆抗体与C0L0205和SKBr_3细胞系表面 表达的EPCAM结合的流式细胞仪检测结果图；图Ia为与C0L0205细胞系结合检测结果图， 图Ib为与SKBr-3细胞系结合检测结果图；其中，FITC 异硫氰酸荧光素，横轴为荧光强度，4纵轴为相对细胞计数，Ml表示阳性细胞范围；图2是抗人EPCAM的FMU_EPCAM_2D7单克隆抗体轻链可变区基因同源性序列检测 结果图；图3是抗人EPCAM的FMU_EPCAM_2D7单克隆抗体重链可变区基因同源性序列检测 结果图；图4是抗人EPCAM的FMU_EPCAM_2D7单克隆抗体轻链可变区氨基酸同源性序列检 测结果图；图5是抗人EPCAM的FMU_EPCAM_2D7单克隆抗体重链可变区氨基酸同源性序列检 测结果图。具体实施例方式申请人:用重组人EPCAM免疫BALB/c小鼠，制备了一组小鼠抗人EPCAM单克隆抗 体，筛选出能稳定分泌高亲和力抗人EPCAM的FMU-EPCAM-2D7单克隆抗体杂交瘤细胞株，制 备腹水获得高亲和力抗人EPCAM单克隆抗体。确认该基因序列和相应蛋白序列的惟一性及 其CDR序列；为抗人EPCAM嵌合或人源化基因工程抗体提供支持。下面结合附图对本专利技术做详细说明，所述是对本专利技术的解释而不是限定。本专利技术具体按以下步骤实施1小鼠抗人EPCAM高亲和力抗体的制备1. 1单克隆抗体的制备、纯化参照GENBANK匪002354序列设计引物，并扩增编本文档来自技高网...
【技术保护点】
ＦＭＵ－ＥＰＣＡＭ－２Ｄ７单克隆抗体的轻链和重链可变区，其特征在于，所述轻链可变区的３个互补决定区（ＣＤＲ）序列分别为： ＣＤＲ１：Ｇｌｎ－Ａｓｎ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ－Ｔｈｒ－Ｔｙｒ； ＣＤＲ２：Ｖａｌ－Ｖａｌ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｓｅｒ； ＣＤＲ３：Ｔｒｐ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｈｉｓ－Ｐｈｅ－Ｐｒｏ－Ｔｒｐ－Ｔｈｒ； 所述重链可变区的３个互补决定区（ＣＤＲ）序列分别为： ＣＤＲ１：Ｇｌｙ－Ｔｙｒ－Ｓｅｒ－Ｐｈｅ－Ｔｙｒ－Ｓｅｒ－Ｔｙｒ－Ｔｒｐ； ＣＤＲ２：Ｉｌｅ－Ｔｙｒ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ａｓｎ－Ｓｅｒ－Ｖａｌ－Ｔｈｒ； ＣＤＲ３：Ｉｌｅ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ａｓｎ－Ｔｙｒ。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：金伯泉，杨琨，张葵，宋朝君，孙元杰，朱参胜，谢鑫，
申请(专利权)人：中国人民解放军第四军医大学，
类型：发明
国别省市：87
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