一种能稳定改变兰花叶色的方法技术

本发明专利技术属于植物基因工程技术领域，具体公开一种能稳定改变兰花叶色性状的方法，具体该方法为，将叶斑艺兰花CcR2R3

【技术实现步骤摘要】
一种能稳定改变兰花叶色的方法


[0001]本专利技术属于植物基因工程
，具体涉及一种能稳定改变兰花叶色性状的方法。

技术介绍

[0002]兰花是进化程度较高的单子叶植物，是最大的被子植物开花家族之一，约700余属2.5万种。兰花泛指兰科（Orchidaceae）植物，主要分布在热带、亚热带地区，具有极高的观赏价值、文化价值和药用价值。兰花株型独特、花姿优美、花色丰富、花朵幽香、花期长，是重要的切花和盆栽花卉，随着科技的发展，人类观赏水平的提升，人们对兰花优良品种的需求也越来越大。兰花经过长期的选育栽培，出现了很多的变异品种，根据观赏部位的不同，分为花艺、叶艺两大类型，其中的叶斑艺兰花起源于中国，在近些年中逐渐被人们认识。“叶艺”在园艺学上称为叶部彩斑（variegation），是观赏植物叶部变异的重要组成部分。其中，兰花叶斑艺品种观赏价值很高，是“精品兰花”的重要特征。明朝咏兰诗中就有看叶胜看花的佳句，人们在追求兰花花艺的同时也在追求兰花植株外形美，叶艺兰凭借其古朴、厚重、矮小的株型以及多样奇异的叶片形态，自古受到人们追捧，其独特的叶斑性状受人们重视并被选为培育的重点。目前，叶艺兰多来自野生兰科植物的天然杂交后代，或在长期培育过程中的自然变异植株，因此，叶艺兰育种存在数量极为稀少，选育时间较长等瓶颈问题，并且艺象也通常不稳定，导致了叶艺兰定向培育极为困难。近年来随着叶艺兰新品种的培育以及公众对叶艺兰深入的鉴赏，出现了不同颜色和形状变异的新类型。然而，传统的杂交育种由于耗时长、生殖隔离等缺点，已难满足目前的花卉市场，因此，运用分子技术培育兰花不同叶色新品种，既能缩短育种年限，又能打破种间界限，为兰花种质创新和性状改良提供了一条便捷的途径。
[0003]针对能稳定改变兰花叶色的基因型，目前尚未见相关报道。

技术实现思路

[0004]本专利技术的主要目的是提供一个可稳定改变兰花叶色的方法，利用植物基因工程技术，遗传转化铁皮石斛，与野生型（WT）植株叶片绿色相比，转基因植株叶色为黄绿色，WT植株叶片的光合色素（叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素）含量均高于转基因植株，且差异极显著。为实现以上目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供一种叶斑艺兰花CcR2R3
‑
MYB基因在植物叶色性状改良中的应用，所述CcR2R3
‑
MYB核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0005]进一步的，本专利技术提供了一种能稳定改变兰花叶色的方法，包括以下步骤：（1）叶斑艺兰花CcR2R3
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MYB基因的扩增，所述CcR2R3
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MYB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；（2）构建重组载体；（3）农杆菌介导的遗传转化；
（4）转基因植物培养、检测。
[0006]优选的，步骤（1）中，叶斑艺兰花CcR2R3
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MYB基因的扩增所用的引物对核苷酸序列如SEQIDNO:3
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4所示。
[0007]优选的，步骤（2）中，用于构建所述重组载体的起始载体为pCAMBIA1301，含有35S启动子，其后紧接CcR2R3
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MYB基因。
[0008]优选的，步骤（3）中，所述农杆菌为EHA105。
[0009]本专利技术还提供了一种重组载体，该重组载体，含有如SEQIDNO:1所示核苷酸序列。
[0010]本专利技术还提供了一种试剂盒，该试剂盒含有扩增如SEQIDNO:1所示核苷酸序列的引物对。
[0011]作为一种实施方式，如SEQIDNO:2所示CcR2R3
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MYB核苷酸序列编码获得的如SEQIDNO:4所示的氨基酸序列可应用在植物叶色性状改良中。
[0012]本专利技术是利用简并引物设计扩增全长的方法从叶斑艺兰花中克隆出CcR2R3
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MYB基因，在铁皮石斛中进行过量表达，并通过农杆菌介导花序浸润法遗传转化拟南芥，实验结果表明在过表达转基因铁皮石斛CcR2R3
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MYB基因能够正常表达，转入过表达CcR2R3
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MYB基因的生长情况比对照植株表现为植株叶色为黄绿色，过量表达CcR2R3
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MYB基因能够很大程度的降低叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量。
附图说明
[0013]图1:CcR2R3
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MYB基因扩增前后凝胶电泳显示图（M:maker2000bp;M：DL2000，1
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4：PCR产物）；图2:CcR2R3
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MYB与其他植物R2R3
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MYB同源比对结果图（CcR2R3
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MYB：叶斑艺兰；DhMYB1：石斛；Dsp.MYB1：石斛变种；DcMYBML1：木石斛；Cemyb
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related：建兰；PeMYB16：小兰屿蝴蝶兰；TaMYB16：小麦；TaMYB77：小麦；Pemyb
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related：小兰屿蝴蝶兰；AtMYB106：拟南芥）；图3CcR2R3
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MYB基因亚细胞定位图（GFP：荧光图像；DIC：差分干涉对比；MERGE：合并图像；标尺=50μm）；图4CcR2R3
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MYB基因菌落PCR（M：DL2000，1：PCR产物）；图5CcR2R3
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MYB基因过表达阳性植株检测电泳图（M：DL2000，
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：阴性对照，+：阳性对照，A：1
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8：PCR产物（引物：hpt557
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F和hpt557
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R），B:1
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4：PCR产物（引物：CcR2R3
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MYB
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F和CcR2R3
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MYB
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R）；图6遗传转化过程图；图7CcR2R3
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MYB基因表达量（****表示p<0.0001）；图8转基因植株总黄酮含量（不同小写字母表示差异显著性(p<0.05)，不同大写字母表示差异极显著性(p<0.01)）；图9转基因植株对比图（WT：野生型铁皮石斛叶片；CcR2R3
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MYB转基因植株叶片；CcR2R3
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MYB转基因植株）；图10光合色素含量（不同大写字母表示差异极显著性(p<0.01)）；图11CcR2R3
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MYB基因过表达载体图（A:PC1300nu
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CcR2R3
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MYB）。
具体实施方式
[0014]为了能够更加清楚地理解本专利技术的技术实质和有益效果，申请人在下面以实施例的方式作详细说明，但是对实施例的描述均不是对本专利技术方案的限制，任何依据本专利技术构思所做出的仅仅为形式上的而非实质性的等效变换都应视为本专利技术的技术方案范畴。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.叶斑艺兰花CcR2R3
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MYB基因在植物叶色性状改良中的应用，其特征在于，所述CcR2R3
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MYB核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。2.一种能稳定改变兰花叶色的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）叶斑艺兰花CcR2R3
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MYB基因的扩增，所述CcR2R3
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MYB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；（2）构建重组载体；（3）农杆菌介导的遗传转化；（4）转基因植物培养和检测。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，叶斑艺兰花CcR2R3
‑
MYB基因的扩增所用的引物对核苷酸序列如SEQ ...

【专利技术属性】
技术研发人员：王玉英，李枝林，姚红旭，
申请(专利权)人：云南农业大学，
类型：发明
国别省市：