一种靶向敲除VASN基因的载体及其应用制造技术

本发明专利技术属于基因编辑技术领域，具体涉及一种靶向敲除VASN基因的载体及其应用。该载体包括：PX459

【技术实现步骤摘要】
一种靶向敲除VASN基因的载体及其应用


[0001]本专利技术属于基因编辑
，具体涉及一种靶向敲除VASN基因的载体及其应用。

技术介绍

[0002]Vasorin(VASN)是一个由673个氨基酸编码的高度保守的跨膜糖蛋白。VASN在血管疾病和多种类型的癌症(包括肝癌、乳腺癌、胶质瘤[和甲状腺癌)中异常表达。在肝癌的研究中，RNA干扰和过表达分析证实，VASN促进细胞增殖和迁移，并抑制细胞凋亡。肝癌细胞中高表达的VASN促进了人脐静脉内皮细胞的迁移。然而，VASN在肝癌发生发展过程中的作用机制尚不完全清楚。因此，构建VASN的条件敲除细胞系，并以此用于VASN基因功能研究以及为后续在动物水平的研究是极为重要的。
[0003]CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)系统是细菌体内的一种免疫防御系统，普遍存在于各类细菌，能特异性降解外源DNA。CRISPR/Cas9系统主要由特异引导gRNA和内切酶Cas9两部分构成，主要依赖的是Cas9核心蛋白，在RNA的介导下，Cas9蛋白能够识别靶序列进行切割造成DNA的双链断裂(double
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strand breaks，DSB)。在此基础上，人们可以对基因组的特定位点进行基因编辑，但是CRISPR/Cas9系统在基因编辑应用方面也具有一定的局限性定的局限性，主要是PAM序列的依赖性、脱靶效应以及只能进行系统性敲除。即CRISPR/Cas9技术只能系统性敲除目的基因，并不能对基因是时空性表达进行调控。
[0004]因此，挖掘一种可以对VASN基因进行时空性表达进行调控的方法是有必要的。

技术实现思路

[0005]针对以上问题，本专利技术目的之一在于提供一种可以靶向敲除VASN基因的载体，该载体是利用CRISPR/Cas9技术的靶向切割敲入LoxP序列再结合Cre
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LoxP系统可以对基因进行时空性调控。该载体能够实现VASN基因的时空性敲除，为后续体外研究VASN在细胞中的功能及在动物体内实现VASN的条件性敲除奠定了分子基础。
[0006]为了达到上述目的，本专利技术可以采用以下技术方案：
[0007]本专利技术一方面提供一种可以靶向敲除VASN基因的载体，其包括：PX459
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VASN
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gRNA1、PX459
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VASN
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gRNA2和donor载体；donor载体包括：含有LoxP序列5
’
端同源臂、含有LoxP序列3
’
端同源臂和含有LoxP序列5
’
端同源臂与含有LoxP序列3
’
端同源臂之间的VASN序列。
[0008]本专利技术另一方面提供一种敲除细胞中VASN基因的方法，包括：将上述的靶向敲除VASN基因的载体转染细胞得LoxP细胞；然后使用Cre重组酶转染LoxP细胞。
[0009]在一些具体实施例中，Cre重组酶可以包括Escherichia virus P1 Cre重组酶、Sphingomonas sp.ERG5Cre重组酶或Salmonella phage SJ46 Cre重组酶。
[0010]在一些具体实施例中，细胞可以包括人细胞、非人哺乳动物细胞和干细胞。
[0011]本专利技术再一方面提供一种上述的敲除细胞中VASN基因的方法制备得到的敲除VASN基因的细胞系。
[0012]本专利技术再一方面提供一种上述的靶向敲除VASN基因的载体在制备修饰VASN基因或调节VASN基因表达试剂盒或药物中的应用。
[0013]本专利技术有益效果包括：本专利技术提供的靶向敲除VASN基因的载体能够实现VASN基因的时空性敲除，为后续体外研究VASN在细胞中的功能及在动物体内实现VASN的条件性敲除奠定了分子基础。
附图说明
[0014]图1为gRNA切割靶点位置与LoxP序列敲入位置示意图；
[0015]图2a为pX459 v2.0质粒结构图；
[0016]图2b为加了Bbs I酶切位点的VASN
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gRNA1；
[0017]图2c为加了Bbs I酶切位点的VASN
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gRNA2；
[0018]图2d为pX459 v2.0与加了Bbs I酶切位点的VASN
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gRNA1连接示意图；
[0019]图2e为pX459 v2.0与加了Bbs I；酶切位点的VASN
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gRNA2连接示意图
[0020]图3a为菌落PCR鉴定电泳结果，1为gRNA1菌落PCR产物，2为gRNA2菌落PCR产物，NC为空白对照组，M：DNA DL500 marker；
[0021]图3b为pX459
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VASN
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gRNA1测序结果；
[0022]图3c为pX459
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VASN
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gRNA2测序结果；
[0023]图4a为菌落PCR鉴定电泳结果，1为donor DNA菌落PCR产物，NC为空白对照组，M：DNADL5000 marker；
[0024]图4b为donor DNA测序结果；
[0025]图5a为LoxP序列敲入AML12细胞系PCR产物电泳结果，1：转染3质粒的AML12细胞gRNA1两端基因序列，2：正常组AML12细胞gRNA1两端基因序列，3：转染3质粒AML12细胞gRNA2两端基因序列，4：正常组细胞gRNA2两端基因序列，M：DNA DL5000 marker；
[0026]图5b为转染3质粒的AML12细胞gRNA1两端基因序列测序结果；
[0027]图5c为转染3质粒的AML12细胞gRNA2两端基因序列测序结果；
[0028]图6a为VASN基因敲除示意图；
[0029]图6b为VASN基因敲除电泳结果，1：单克隆细胞株LoxP
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VASN
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AML12(转染pALB
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Cre质粒)；2：正常组AML12细胞(转染pALB
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Cre质粒)；M：DNA DL5000 marker；
[0030]图7为qRT
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PCR检测稳定敲除细胞株的mRNA表达水平图；其中，WT：正常组AML12细胞；KO：敲除VASN的AML12细胞。
具体实施方式
[0031]所举实施例是为了更好地对本专利技术进行说明，但并不是本专利技术的内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述
技术实现思路
对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本专利技术的保护范围。
[0032]本文中使用的术语仅用于描述特定实施例，并且无意于限制本公开。除非在上下文中具有明显不同的含义，否则单数形式的表达包括复数形式的表达。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种靶向敲除VASN基因的载体，其特征在于，包括：PX459
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VASN
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gRNA1、PX459
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VASN
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gRNA2和donor载体；donor载体包括：含有LoxP序列5
’
端同源臂、含有LoxP序列3
’
端同源臂和含有LoxP序列5
’
端同源臂与含有LoxP序列3
’
端同源臂之间的VASN序列。2.根据权利要求1所述的靶向敲除VASN基因的载体，其特征在于，gRNA1的序列如SEQ ID N0.1所示，gRNA2的序列如SEQ ID N0.2所示。3.根据权利要求1或2所述的靶向敲除VASN基因的载体，其特征在于，PX459
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VASN
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gRNA1和PX459
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VASN
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gRNA2的制备方法包括：利用BbsI酶对PX459骨架载体进行酶切，回收酶切后的线性化PX459骨架载体，将其与退火后的gRNA双链进行连接获得质粒PX459
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VASN
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gRNA1和PX459
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VASN
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gRNA2。4.根据权利要求1或2所述的靶向敲除VASN基因的载体，其特征在于，donor载体的制备方法包括：选择合适的LoxP敲入位点；利用EcoRV限制性内切酶对pUC57质粒进行酶切；设计引物扩增得到含有LoxP序列5
’
端同源臂、含有LoxP序列3
’
端同源臂和含有LoxP序列5
’
端同源臂与含有LoxP序列3
’
端同源臂之间的VASN序列；将含有LoxP序列5
’
端同源臂、含有LoxP序列3
’
端同源臂和含有LoxP序列5
’
端同源臂与含有LoxP序列3
’
端同源臂之间的VASN序列克隆到pUC57获得donor载体。5.根据权利要求4所述的靶向敲除VASN基因的载体，其特征在于，扩增得到含有LoxP序列5
’
端同源臂的引...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨丽超，甘暨，张起，何敏，孙俊铭，
申请(专利权)人：广西医科大学，
类型：发明
国别省市：