用于生产岩藻糖基乳糖的遗传修饰的棒状杆菌制造技术

本发明专利技术涉及一种用于生产岩藻糖基乳糖的遗传修饰的棒状杆菌，其中所述棒状杆菌已被修饰以从外源核酸序列表达用于乳糖输入的通透酶、GDP

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于生产岩藻糖基乳糖的遗传修饰的棒状杆菌
[0001]本专利技术涉及用于生产岩藻糖基乳糖的遗传修饰的棒状杆菌(corynebacterium)，其中所述棒状杆菌被修饰以从外源核酸序列表达用于乳糖输入的通透酶、GDP
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D
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甘露糖
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4,6
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脱水酶(GMD)、GDP
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L
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岩藻糖合酶(WcaG)和岩藻糖基转移酶(FucT)，其特征在于，编码用于乳糖输入的通透酶、GMD、WcaG和FucT的外源核酸序列整合在染色体上。优选地，棒状杆菌还包含用于表达磷酸甘露糖变位酶(ManB)和GTP
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甘露糖
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磷酸鸟苷基转移酶(ManC)的染色体整合的外源核酸序列。在优选的实施方案中，棒状杆菌为谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)。在实施方案中，棒状杆菌对于参与棒状杆菌细胞壁生物合成的一种或多种糖基转移酶的功能性表达有缺陷。
[0002]专利技术背景
[0003]人类母乳含有200多种结构不同的寡糖，以下称为母乳寡糖(HMO)，通常浓度范围为5至25g/l。它们的成分和浓度在哺乳期间会发生变化，并进一步取决于母亲的遗传、饮食和健康状况。HMO的存在可显着减轻婴儿在免疫系统成熟期间/之前的急性感染。临床实践中使用的几种HMO已被证明可以保护婴儿和成人免受细菌和病毒感染。此外，据报道，一些HMO成分可以促进婴儿的认知发展并刺激有益的肠道微生物群。因此，近年来，HMO作为人类营养的治疗剂和健康补充剂越来越受到关注。
[0004]岩藻糖基化的HMO，特别是α1,2
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岩藻糖基乳糖(2FL)和α1,3
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岩藻糖基乳糖(3FL)是母乳中的主要寡糖，其含量分别为12
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45％和0.5
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8％。2
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FL(Fucα1
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2[Galβ1
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4]Glc)由L
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岩藻糖通过α1
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2键与乳糖中的半乳糖残基连接而成，其异构体3
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FL(Fucα1
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3Galβ1
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4Glc)由L
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岩藻糖通过α1
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3键与乳糖中的葡萄糖部分连接。2FL促进肠道菌群中双歧杆菌的早期发生，并预防共生菌引起的婴儿腹泻疾病。已知约20％的欧美女性由于岩藻糖基转移酶基因的基因突变而无法合成2FL。而对于能够产生2FL的女性，其在乳汁中的浓度在哺乳期间会降低。因此，2FL作为婴幼儿配方乳粉中的功能性食品成分引起了广泛关注。由于这些原因，需要生产2FL。
[0005]家畜的乳汁中岩藻糖基化HMO不存在，或以低100至1000倍的浓度存在。来自家畜的寡糖的组成和种类与HMO显着不同；此外，从动物奶或乳清中提取并不是大规模生产的商业可行选择。化学合成由于多步骤合成而具有挑战性，并且伴随着使用昂贵的底物、低立体选择性、低产率和使用有毒有机溶剂的缺点。由于使用昂贵的底物以及岩藻糖基转移酶的不稳定和低表达，生物催化合成在扩大规模方面的适用性有限。使用重组微生物进行2FL生产克服了化学和酶合成的缺点，并具有利用廉价底物进行扩大规模和工业生产的额外优势。
[0006]大多数常规的使用微生物生产2'
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岩藻糖基乳糖的方法是使用重组大肠杆菌(Escherichia coli)生产的。然而，大多数用于实验的大肠杆菌虽然不是病原体，但已知主要对顾客是有害的。由于大肠杆菌细胞膜的成分可以作为内毒素，因此在从大肠杆菌生产2'
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岩藻糖基乳糖中涉及高分离和纯化(下游加工)成本。因此，使用大肠杆菌作为宿主细胞生产岩藻糖基乳糖作为食品和药材成分存在困难。
[0007]为了避免使用(潜在的)人类病原体大肠杆菌来生产岩藻糖基乳糖的缺点，
production.”J Bacteriol，2000；182(10):2696
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2701)。尽管Tuo等人通过经典诱变鉴定出与较高谷氨酸输出相关的突变基因，但没有对它们与野生型酶的催化活性进行比较。此外，一些物种在不同生长温度下的转录组变化也有很好的记录。除了各基因表达的改变之外，这也可能是谷氨酸排泄的一个促成因素。其中两种酶Cgl0688和Cgl0366是丙酮酸脱氢酶(PDH)的必要成分，与参与丙酮酸节点的乙酰辅酶A合成相关。FabG和cgl0286与脂肪酸合成有关。cg2090、cgl2139和cgl0628三个基因的作用尚不清楚。
[0014]据推测，棒状杆菌形成的产物从内质膜扩散到发酵培养基，并且由于具有大量非共价连接的脂质和厚肽聚糖层的分枝菌酸酯(mycolate)层的存在，即使在主动转运蛋白存在的情况下，其水平也很低。分枝菌酸是通过酯键与附着在细胞壁胞壁质上的阿拉伯半乳糖聚糖连接的脂质(Minnikin D.E.等人，1987，“Chemical targets in cell envelopes”，第19
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43页；M.Hopper(ed.),Chemotherapy of tropical diseases.，John Wiley&Sons Ltd.,Chichester，英国)。棒状杆菌中这些脂质的链长为22至38个碳原子(Yano等人，1972年，“Gas chromatographic and mass spectrometric analysis of molecular species of corynomycolic acids from Corynebacterium ulcerans.”，FEBS Lett.，23:352
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356)。
[0015]然而，在鉴定代谢工程化棒状杆菌菌株产生的非天然化合物的细胞外输出物方面存在瓶颈(P
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Garc
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a F.等人，“Transport and metabolic engineering of the cell factory Corynebacterium glutamicum.”，FEMS Microbiol Lett.，2018；365(16))。
[0016]因此，需要找到新的、可靠的策略来操纵所产生的化合物的细胞输出。本文追求的一种策略是靶向参与细胞壁不同层形成的酶。结果发现，这可能是开发可行的工业生物技术工艺的快速且适用的策略。
[0017]此外，据报道，使用谷氨酸棒状杆菌生产生物分子是不利的，因为细菌在发酵过程中产生泡沫的倾向很强。事实上，谷氨酸棒状杆菌培养物在搅拌槽式生物反应器中的搅拌和曝气总是会引起起泡，而过量的泡沫迫使液体培养基流出生物反应器并污染系统。因此，必须进行费力的优化实验来确定最佳曝气条件，必须维持该最佳曝气条件以最小化起泡并使比生产速率最大化。
[00本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.用于生产岩藻糖基乳糖的遗传修饰的棒状杆菌，其中所述棒状杆菌已被修饰以从外源核酸序列表达用于乳糖输入的通透酶、GDP
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D
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甘露糖
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4,6
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脱水酶(GMD)、GDP
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L
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岩藻糖合酶(WcaG)和岩藻糖基转移酶(FucT)，其特征在于，编码用于乳糖输入的通透酶、GMD、WcaG和FucT的所述外源核酸序列是经染色体整合的。2.根据权利要求1所述的遗传修饰的棒状杆菌，其中所述棒状杆菌另外包含用于表达磷酸甘露糖变位酶(ManB)和GTP
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甘露糖
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磷酸鸟苷基转移酶(ManC)的经染色体整合的外源核酸序列。3.根据前述权利要求中任一项所述的遗传修饰的棒状杆菌，其中所述棒状杆菌是谷氨酸棒状杆菌。4.根据前述权利要求中任一项所述的遗传修饰的棒状杆菌，其中所述FucT是α
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1,2
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FucT。5.根据前述权利要求中任一项所述的遗传修饰的棒状杆菌，其中所述用于乳糖输入的通透酶是乳糖通透酶(LacY)。6.根据前述权利要求中任一项所述的遗传修饰的棒状杆菌，
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其中所述棒状杆菌包含至少两个编码FucT的外源核酸序列，
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其中优选地i.第一FucT编码序列来自幽门螺杆菌和/或第一FucT编码序列的表达受Trc启动子控制，并且ii.第二FucT编码序列是由鼬鼠螺杆菌优化的密码子和/或第二FucT编码序列的表达由Tuf启动子控制。7.根据前述权利要求中任一项所述的遗传修饰的棒状杆菌，
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其中所述棒状杆菌在单个操纵子内的连续外源核酸序列中包含至少两个编码WcaG和GMD的外源核酸序列，
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其中优选地i.第一WcaG和GMD编码操纵子由Tac启动子控制和/或第一WcaG和GMD编码操纵子是来自大肠杆菌，并且ii.第二WcaG和GMD编码操纵子由Tuf启动子控制和/或第二WcaG和GMD编码操纵子是来自脆弱类杆菌。8.根据前述权利要求中任一项所述的遗传修饰的...

【专利技术属性】
技术研发人员：乌玛，
申请(专利权)人：佳乐博实验室有限责任公司，
类型：发明
国别省市：