一种转氨酶及酶催化制备(R)-1-Boc-3-氨基吡咯烷的方法技术

本发明专利技术属于生物催化技术领域，具体涉及一种转氨酶及酶催化制备(R)

【技术实现步骤摘要】
一种转氨酶及酶催化制备(R)
‑1‑
Boc
‑3‑
氨基吡咯烷的方法


[0001]本专利技术属于生物催化
，具体涉及一种转氨酶及酶催化制备(R)
‑1‑
Boc
‑3‑
氨基吡咯烷的方法。

技术介绍

[0002](R)
‑1‑
Boc
‑3‑
氨基吡咯烷(CAS：147081
‑
49
‑
0)为杂环有机物，可被广泛应用于农药，医药领域的合成，其中作为第五代头孢菌素类抗生素头孢吡普合成的重要中间体，具有良好的市场前景。
[0003]目前生产(R)
‑1‑
Boc
‑3‑
氨基吡咯烷的方法主要为化学法，酶催化合成是生产(R)
‑1‑
Boc
‑3‑
氨基吡咯烷生产的重要发展方向。专利CN2014106524072报道了一种来源于土曲霉(Aspergillus terreus)的转氨酶Ate
‑
ATA催化N
‑
Boc
‑3‑
氨基呲咯烷酮转化为(R)
‑1‑
Boc
‑3‑
氨基吡咯烷的方法，但是该方法的转化率只有11％；专利CN 114277008A公开了一种(R)
‑
选择性转氨酶催化催化1
‑
叔丁氧羰基
‑3‑
吡咯烷酮生成(R)
‑1‑
Boc
‑3‑<br/>氨基吡咯烷的方法，ee值保持在99.8％以上，但转化率在62～85％之间，仍存在转化率低、反应后产物分离难度大、成本高等的缺点。
[0004]寻找一种更高效催化合成(R)
‑1‑
Boc
‑3‑
氨基吡咯烷的转氨酶，并优化合成条件，具有重要的生产和应用价值。

技术实现思路

[0005]为了解决上述技术问题，本专利技术首先提供了一种转氨酶，该转氨酶包括ATA
‑
104、ATA
‑
106、ATA
‑
116中的任意一种或多种的组合，所述ATA
‑
104的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述ATA
‑
106的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述ATA
‑
116的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0006]本专利技术还提供一种多核苷酸，其编码如上所述的ATA
‑
104、ATA
‑
106、ATA
‑
116中任一种转氨酶，其中编码ATA
‑
104的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，编码ATA
‑
106的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，编码ATA
‑
116的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
[0007]本专利技术的目的之三在于提供一种如上所述的转氨酶在催化N
‑
Boc
‑3‑
吡咯烷酮生成(R)
‑1‑
Boc
‑3‑
氨基吡咯烷中的应用。
[0008]本专利技术的目的之四在于提供一种(R)
‑1‑
Boc
‑3‑
氨基吡咯烷的制备方法，利用如上所述的转氨酶催化N
‑
Boc
‑3‑
吡咯烷酮生成(R)
‑1‑
Boc
‑3‑
氨基吡咯烷，包括以下步骤：
[0009]S1.将反应容器置于35
‑
45℃水浴环境中，搅拌并加入含有底物N
‑
Boc
‑3‑
吡咯烷酮和转氨酶的反应液，保温反应18～24小时；
[0010]S2.反应结束后，调节反应液pH值为10～11，将反应液过滤，得到滤液；
[0011]S3.滤液用等体积的乙酸乙酯萃取3次，萃取后合并有机相，再用饱和食盐水洗涤，洗涤后加入无水Na2SO4干燥，最后减压蒸馏得到纯化产物，该纯化产物为(R)
‑1‑
Boc
‑3‑
氨基吡咯烷。
[0012]优选的，所述反应液由底物N
‑
Boc
‑3‑
吡咯烷酮、转氨酶、助溶剂、PLP、异丙胺和Tris
‑
盐酸缓冲液混合组成，其中，所述N
‑
Boc
‑3‑
吡咯烷酮质量占总反应体系体积的5～30％，单位为g/ml；所述转氨酶用量为N
‑
Boc
‑3‑
吡咯烷酮质量的50～150％，所述异丙胺使用量为1～5eq，PLP用量为N
‑
Boc
‑3‑
吡咯烷酮质量的0.1％
‑
5％；所述助溶剂为CAN(乙腈)、EA(丙烯酸乙酯)、PE(石油醚)、DMSO(二甲基亚砜)中的任意一种或多种的组合，助溶剂体积用量占总反应体系体积的5～50％。所述Tris
‑
盐酸缓冲液用于提供酶催化反应所需的水环境，以及维持pH和提供一定的离子浓度。
[0013]优选的，所述助溶剂为乙酸乙酯。
[0014]优选的，所述转氨酶为ATA
‑
116。
[0015]本专利技术的有益效果为：
[0016]本专利技术提供了三种新的转氨酶ATA
‑
104、ATA
‑
106、ATA
‑
116，均能够催化N
‑
Boc
‑3‑
吡咯烷酮生成(R)
‑1‑
Boc
‑3‑
氨基吡咯烷，其中ATA
‑
116的反应转化率达99％，光学纯度大于99％，优于现有的酶反应转化率。本专利技术中的酶活性高，使用少量酶催化即可实现高的转化率，获得高纯度的(R)
‑1‑
Boc
‑3‑
氨基吡咯烷，并且使用酶量少也能够降低后续处理工艺难度，大大降低生产成本，具有较好的应用前景。
附图说明
[0017]图1为实施例2制备产物的气相色谱结果，保留时间为15.121min处峰为(R)
‑1‑
Boc
‑3‑
氨基吡咯烷。
具体实施方式
[0018]除非另有说明，本文中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。如无特殊说明本文中所使用的术语均具有本领域技术人员常规理解的含义。
[0019]采用现有的通用方法，利用微生物制备重组转氨酶，一个典型过程为：将转氨酶基因合成后无缝克隆至pET
‑
28(a)+质粒中，转染至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，转化液涂布到含有卡那霉素的LB平板上，37℃倒置培养过夜，获得阳性本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种转氨酶，其特征在于，该转氨酶包括ATA
‑
104、ATA
‑
106、ATA
‑
116中的任意一种或多种的组合，所述ATA
‑
104的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述ATA
‑
106的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述ATA
‑
116的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。2.一种多核苷酸，其编码如权利要求1所述的ATA
‑
104、ATA
‑
106、ATA
‑
116中任一种转氨酶，其中编码ATA
‑
104的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，编码ATA
‑
106的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，编码ATA
‑
116的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。3.一种如权利要求1所述的转氨酶在催化N
‑
Boc
‑3‑
吡咯烷酮生成(R)
‑1‑
Boc
‑3‑
氨基吡咯烷中的应用。4.一种(R)
‑1‑
Boc
‑3‑
氨基吡咯烷的制备方法，其特征在于，利用如权利要求1所述的转氨酶催化N
‑
Boc
‑3‑
吡咯烷酮生成(R)
‑1‑
Boc
‑3‑
氨基吡咯烷，包括以下步骤...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐圆圆，刘家余，王娇，熊艳，
申请(专利权)人：卡柔恩赛生物技术重庆有限公司，
类型：发明
国别省市：