一种活细胞内多靶标级联实时动态检测方法及应用技术

本发明专利技术属于分子生物学技术领域，公开了一种活细胞内多靶标级联实时动态检测方法及应用，具体公开了一组检测核酸的HCR

【技术实现步骤摘要】
一种活细胞内多靶标级联实时动态检测方法及应用


[0001]本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种活细胞内多靶标级联实时动态检测方法及应用。

技术介绍

[0002]恶性肿瘤在全世界大多数国家/地区中占据死亡原因的首位，严重威胁人类的健康和生命。临床常用影像学或组织学等手段从不同角度进行诊断，在一定程度上提高了恶性肿瘤早期诊断率，但仍存在滞后性且敏感性差等局限。大部分患者在早期并无明显症状，一部分恶性程度高的肿瘤，即使原发病灶很小，也可能会发生扩散、转移，而目前临床手段很难对微小病灶进行精准诊断。临床上恶性肿瘤治疗以手术为主，化疗或放疗辅助进行，但可能会对癌细胞和正常细胞都造成损伤，且有复发转移风险。肿瘤标志物的发现为早期恶性肿瘤的精准诊断提供了新的策略，对肿瘤标志物的精准灵敏检测，可实现恶性肿瘤早期精准诊断，对恶性肿瘤早发现、早治疗具有重要意义。
[0003]目前已有研究表明，microRNA(miRNA)在细胞中的表达水平与肿瘤恶性程度密切相关，许多miRNA的表达在肿瘤发生、发展的各个阶段发生显著改变，能在分子水平上为恶性肿瘤早期诊断提供依据。因此，开展活细胞内miRNA原位分析，对恶性肿瘤的早期诊断与早治疗具有重要意义。由于miRNA丰度低、结构短、家族成员序列相似度高且在细胞内的表达动态变化，实现活细胞内miRNA的原位检测仍面临以下难点：(1)鉴于miRNA在细胞内丰度低且同源相似度高的特点，解决miRNA活细胞检测，首先需克服恒温条件下活细胞内的高效、高特异性扩增瓶颈问题；(2)恶性肿瘤作为一种多阶段疾病，检测单一类型的肿瘤标志物可能带来的假阳性或者假阴性的结果，难以有效实现特异性乳腺癌的精准分析；(3)在复杂体系中存在功能核酸探针进入细胞效率低，且探针传递不均匀、循环时间短、易被水解等问题。

技术实现思路

[0004]本专利技术第一方面的目的，在于提供一组检测核酸的HCR
‑
DNAzyme探针。
[0005]本专利技术第二方面的目的，在于提供一种复合纳米探针。
[0006]本专利技术第三方面的目的，在于提供本专利技术第二方面的复合纳米探针的制备方法。
[0007]本专利技术第四方面的目的，在于提供一种试剂盒。
[0008]本专利技术第五方面的目的，在于提供本专利技术第一方面的HCR
‑
DNAzyme探针、本专利技术第二方面的复合纳米探针或本专利技术第四方面的试剂盒的应用。
[0009]本专利技术第六方面的目的，在于提供一种基于HCR
‑
DNAzyme的多重肿瘤标志物同时检测的DNA逻辑门串联系统。
[0010]本专利技术第七方面的目的，在于提供一种非疾病诊断用途的核酸检测方法。
[0011]为了实现上述目的，本专利技术所采取的技术方案是：
[0012]本专利技术第一个方面，在于提供一组检测核酸的HCR
‑
DNAzyme探针，包含探针H1、探
针H2和底物链S；所述探针H1的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述探针H2的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示，所述底物链S的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
[0013]优选地，所述HCR
‑
DNAzyme探针还包括底物链的互补链C，所述底物链的互补链序列C的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
[0014]优选地，所述探针H1和探针H2上修饰有荧光基团。
[0015]优选地，所述底物链S上修饰有rA，且rA两端修饰有荧光基团与猝灭基团，
[0016]优选地，所述荧光基团包括Cy5、Cy3、Alexa488、Rhodamine和FITC中的任意一种。
[0017]优选地，所述猝灭基团包括Dabcyl、BHQ1、BHQ2、BHQ3中的任意一种。
[0018]优选地，当所述探针H1修饰的荧光基团为Cy3，所述探针H2修饰的荧光基团为Cy5；或所述探针H1修饰的荧光基团为Cy5，所述探针H2修饰的荧光基团为Cy7；或所述探针H1修饰的荧光基团为Cy3，所述探针H2修饰的荧光基团为Alexa488；或所述探针H1修饰的荧光基团为Rhodamine，所述探针H2修饰的荧光基团为FITC。所述探针H1修饰的荧光基团与所述探针H2修饰的荧光基团之间可以发生荧光共振能量转移。
[0019]荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET)是指两个不同的荧光发色基团，其中一个荧光发色基团(供体)的发射光谱与另一荧光发色基团(受体)的吸收光谱有一定的重叠，当供体分子被激发后，受体与供体相距一定合适的距离，且供体和受体的基态及第一电子激发态两者的振动能级间的能量差相互适应时，处于激发态的供体将把一部分或全部能量通过偶极子的介导转移给受体，使受体被激发，在整个能量转移过程中，不涉及光子的发射和重新吸收。本专利技术在探针H1和探针H2上分别修饰荧光基团，在两个探针发生杂交链反应后，两个荧光基团会因为靠近，导致荧光共振能量转移，从而实现对目标核酸的检测。
[0020]优选地，所述核酸包括miR
‑
21和Ki
‑
67。
[0021]本专利技术第二个方面，在于提供一种复合纳米探针，包括本专利技术第一方面的HCR
‑
DNAzyme探针。
[0022]优选地，所述复合纳米探针还包括MOF纳米材料。
[0023]优选地，所述MOF纳米材料为ZIF
‑
8。
[0024]优选地，所述ZIF
‑
8由2
‑
甲基咪和乙酸锌制备得到。
[0025]优选地，所述复合纳米探针的水合粒径为170～250nm。
[0026]优选地，所述复合纳米探针具有菱形十二面体结构。
[0027]优选地，所述复合纳米探针的表面电荷为
‑
41.66mV。
[0028]本专利技术第三个方面，在于提供本专利技术第二方面的复合纳米探针的制备方法，包括以下步骤：采用一锅法将本专利技术第一方面的HCR
‑
DNAzyme探针与2
‑
甲基咪唑混合，搅拌，与乙酸锌混合，搅拌，得到复合纳米探针。
[0029]优选地，所述搅拌的条件为20～25℃800rpm搅拌5～25min。
[0030]优选地，所述制备方法还包括离心、洗涤步骤。
[0031]优选地，所述离心的条件为10000～12000rpm离心4～10min。
[0032]本专利技术第四个方面，在于提供一种试剂盒，包括本专利技术第一方面的HCR
‑
DNAzyme探针和/或本专利技术第二方面的复合纳米探针。
[0033]本专利技术第五个方面，在于提供(1)～(3)中任一种在非疾病诊断用途的核酸检测中
的应用或制备用于诊断或辅助诊断早期癌症的产品中的应用：
[0034](1)本专利技术第一方面的HCR...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一组检测核酸的HCR
‑
DNAzyme探针，包含探针H1、探针H2和底物链S；所述探针H1的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述探针H2的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示，所述底物链S的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。2.根据权利要求1所述的HCR
‑
DNAzyme探针，其特征在于，所述HCR
‑
DNAzyme探针还包括底物链的互补链C，所述底物链的互补链序列C的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；优选地，所述探针H1和探针H2上修饰有荧光基团；优选地，所述底物链S上修饰有rA，且rA两端修饰有荧光基团与猝灭基团；优选地，所述荧光基团包括Cy5、Cy3、Alexa488、Rhodamine和FITC中的任意一种。3.一种复合纳米探针，包括权利要求2所述的HCR
‑
DNAzyme探针。4.根据权利要求3所述的复合纳米探针，其特征在于，所述复合纳米探针还包括MOF纳米材料；优选地，所述MOF纳米材料为ZIF
‑
8；优选地，所述ZIF
‑
8由2
‑
甲基咪唑和乙酸锌制备得到。5.根据权利要求3或4所述的复合纳米探针，其特征在于，所述复合纳米探针的水合粒径为170～250nm；优选地，所述复合纳米探针具有菱形十二面体结构。6.权利要求4或5中所述的复合纳米探针的制备方法，包括以下步骤：采用一锅法将权利要求2所述的HCR
‑
DNAzyme探针与2
‑
甲基咪唑混合，搅拌，与乙酸锌混合，搅拌，得到复合纳米探针；优选地，所述搅拌的条件为20～25℃800rpm搅拌5～25min。7....

【专利技术属性】
技术研发人员：谢妮，杨慧慧，陈栋，
申请(专利权)人：深圳市第二人民医院深圳市转化医学研究院，
类型：发明
国别省市：