本发明专利技术属于生物工程技术领域，具体为一种高效表达糖化酶的马克斯克鲁维酵母重组工程菌株及其应用。本发明专利技术提供的马克斯克鲁维酵母工程菌株，是通过将序列优化后的食腺嘌呤芽生葡萄孢酵母糖化酶基因克隆到表达载体上，并转化由酵母人工染色体介导的二硫键异构途径重构的马克斯克鲁维酵母宿主菌株构建所得。本发明专利技术还提供马克斯克鲁维酵母的人工染色体，用于介导毕赤酵母或马克斯克鲁维酵母二硫键异构途径在马克斯克鲁维酵母中重构。本发明专利技术提供的重组表达糖化酶的马克斯克鲁维酵母工程菌株，高密度发酵72小时糖化酶表达水平达到8345.7U/mL，蛋白产量16.8g/L。本发明专利技术提供的马克斯克鲁维酵母重组工程菌株，可应用于食品加工、酿造、生物医药等领域糖化酶的高效制备。生物医药等领域糖化酶的高效制备。生物医药等领域糖化酶的高效制备。
【技术实现步骤摘要】
高效表达糖化酶的马克斯克鲁维酵母重组工程菌株及其应用
[0001]本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种高效表达糖化酶的马克斯克鲁维酵母重组工程菌株及其应用。
技术介绍
[0002]糖化酶(Glucoamylase,EC3.2.1.3)又称为葡萄糖淀粉酶，能够水解淀粉(其他底物如糊精、糖原等)非还原性末端的α
‑
1,4糖苷键产生葡萄糖，也能缓慢水解α
‑
1,6葡萄糖苷键转化为葡萄糖，是一类重要的工业酶制剂，广泛应用于食品工业、酿造、医药等领域，有很高的应用价值。工业上发酵生产糖化酶主要采用黑曲霉、米曲霉、泡盛曲霉、土曲霉等天然产酶菌。但现有技术存在产物纯化困难、发酵废菌渣难以处理、底物葡萄糖消耗成本较高等一系列问题，使得利用黑曲霉生产糖化酶的成本高昂。为提升糖化酶天然产生菌的产酶水平，紫外诱变、电子束辐照诱变、N
+
注入等诱变手段常用于曲霉菌的高产选育，但要求菌株筛选通量高，而且存在稳定性低的问题。
[0003]重组表达技术是另一种糖化酶生产方法。黑曲霉糖化酶在酿酒酵母中分泌表达的产量28.86IU/mL(刘加爱等，华北农学报，2017,32(6):121
‑
125)，在毕赤酵母中发酵96h表达产量为380.78U/mL(曹慕琛等，安徽农业科学，2011，39：8226
‑
8306)。食腺嘌呤芽生葡萄孢酵母(Arxula adeninivorans)来源的糖化酶BadGLA是另一种研究较为深入的糖化酶，在A.adeninivorans Ls3中天然表达的胞外酶活为3.81nkat/mL，在酿酒酵母INVSC2中重组表达的胞外酶活为6.2nkat/mL(Bui et al.,Appl Microbiol Biotechnol,1996:44,610
–
619)。在K.lactis JA6中重组表达的胞外酶活为101nkat/mL(Bui et al.,Appl Microbiol Biotechnol,1996:45,102
–
106)。在K.lactis BT16中重组表达的胞外酶活为113
±
36mU/mL(Morlino et al.,Appl Environ Microbiol.1999；65:4808
‑
13)。在K.lactis MW278
‑
20C中重组表达的胞外酶活为3
×
10
‑9U/cell(Raimondi et al.,Appl Environ Microbiol.2008:74,7130
‑
7137)。在K.marxianus L3中重组表达的胞外酶活为80U/L(Raimondi et al.,Microb Cell Fact.2013,12:34)。由此可见，糖化酶重组表达产量较低水平，难以达到工业生产的需求。
[0004]马克斯克鲁维酵母Kluyveromyces marxianus在重组蛋白表达领域有着广泛应用，在生产食用、饲用和药用蛋白领域具有得天独厚的优势。此外，马克斯克鲁维酵母具有生长速率快，能够在较短时间内达到较高生物量、蛋白量高、生长温度广等特征，更适合工业生产与应用，目前已经成功用于高效表达各类异源蛋白质和有经济价值的产品如菊粉酶、木质纤维素酶类、多聚半乳糖醛酸酶、阿魏酸酯酶、病毒样颗粒以及乙醇等。
[0005]蛋白质分泌表达涉及易位、糖基化修饰、折叠、运输和分类等过程。其中，内质网是分泌蛋白进行折叠、修饰和质量控制的主要场所，为了正确折叠以形成天然构象。二硫键的形成对于在分泌蛋白质的折叠中非常重要。在新生的多肽链中，半胱氨酸残基呈硫醇形式，需要氧化成二硫化物再异构化为正确的二硫键模式。对于多个半胱氨酸的蛋白质，不正确的二硫键合模式的数量随着半胱氨酸数量的增加而迅速增加，而正确的二硫化物键合模式
数量保持不变。因此，二硫异构酶在蛋白质折叠中起着至关重要的作用，尤其是对于具有多个半胱氨酸残基的蛋白质。在真核生物的内质网中，该过程主要通过二硫键异构酶(Pdi1)和膜相关的氧化还原酶(Ero1和Erv2)组成的途径完成，Pdi1负责催化底物蛋白中的二硫键的形成，而Ero1(/Erv2)则负责为Pdi1提供上游氧化力，这一过程消耗O2，同时产生H2O2。此外，Pdi1蛋白除了具有二硫键异构酶的作用外，还在内质网到高尔基体的运输过程中发挥分子伴侣的作用。
[0006]糖化酶BadGLA的氨基酸序列中存在两个半胱氨酸，AlphaFold结构预测表明正确折叠的糖化酶BadGLA第19位半胱氨酸和第42位的半胱氨酸之间形成一对二硫键。研究者对SLCTBASE数据库中含有二硫键的215条多肽链的二硫键分布特征进行了统计分析，发现在肽链的前1/4处形成的二硫键数目占二硫键总数的40％，表明二硫键更倾向于在肽链前端形成，说明蛋白质翻译过程中，新生肽链在延伸起始阶段形成正确二硫键，对于后面多肽链的延伸和折叠非常重要(宋江宁等，无锡轻工大学学报，2002，21：464
‑
467)。
技术实现思路
[0007]鉴于糖化酶在酵母中重组表达产量低这一现状，本专利技术的目的在于提供一种高效表达糖化酶的马克斯克鲁维酵母重组工程菌株及其应用。
[0008]本专利技术提供的高效表达糖化酶马克斯克鲁维酵母重组工程菌株，由如下步骤构建得到：
[0009](1)构建含酵母二硫键异构途径基因的马克斯克鲁维酵母人工染色体；
[0010](2)将含二硫键异构途径基因的酵母人工染色体导入马克斯克鲁维酵母，获得重构二硫键异构途径的马克斯克鲁维酵母；
[0011](3)将糖化酶基因克隆到马克斯克鲁维酵母重组表达载体；
[0012](4)将步骤(3)获得重组表达载体导入步骤(2)得到的重构二硫键异构途径的马克斯克鲁维酵母菌株中，筛选获得高效表达糖化酶的马克斯克鲁维酵母重组工程菌株。
[0013]其中：
[0014]步骤(1)中，所述酵母二硫键异构途径基因为ERO1、ERV2、PDIA1、PDIA6和RAB1A中一个或多个；其中，二硫键异构基因的来源可以是毕赤酵母或马克斯克鲁维酵母；优选地，为毕赤酵母。
[0015]步骤(1)中，所述马克斯克鲁维酵母人工染色体，包含如下基本元件：酵母复制起始序列ARS1，着丝粒CEN，端粒TEL序列，筛选标记基因为组氨酸合成酶基因HIS3、色氨酸合成酶基因TRP1和潮霉素抗性基因HphMX4等。其中，端粒TEL序列可以源自马克斯克鲁维酵母或四膜虫中一种。含四膜虫端粒的酵母人工染色体载体核苷酸序列为SEQ ID No.1所示，含马克斯克鲁维酵母端粒的酵母人工染色体载体核苷酸序列为SEQ ID No.2所示。
[0016]步骤(1)所述构建含酵母二硫键异构途径基因的马克斯克鲁维酵母人工染色体，具体方法如下：首先PCR扩增毕赤酵母(或马克斯克鲁维酵母)二硫键异构途径等相关基因的编码本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种高效重组表达糖化酶的马克斯克鲁维酵母工程菌株，其特征在于，由如下步骤构建得到：(1)构建含酵母二硫键异构途径基因的马克斯克鲁维酵母人工染色体；(2)将含二硫键异构途径基因的酵母人工染色体导入马克斯克鲁维酵母；所述马克斯克鲁维酵母为FIM
‑
1；宿主菌株马克斯克鲁维酵母FIM
‑
1经过分子生物学方法，敲除基因组上的基因URA3、HIS3或TRP1中的一个或多个，以此作为筛选标记基因；(3)将糖化酶基因克隆到马克斯克鲁维酵母重组表达载体；(4)将步骤(3)获得重组表达载体导入步骤(2)得到的马克斯克鲁维酵母菌株中，获得高效表达糖化酶的马克斯克鲁维酵母工程菌株。2.根据权利要求1所述的马克斯克鲁维酵母工程菌株，其特征在于：步骤(1)中，所述酵母二硫键异构途径基因为ERO1、ERV2、PDIA1、PDIA6和RAB1A中一个或多个；其中，二硫键异构基因的来源是毕赤酵母或马克斯克鲁维酵母；步骤(1)中，所述马克斯克鲁维酵母人工染色体，包含如下基本元件：酵母复制起始序列ARS1，着丝粒CEN，端粒TEL序列，筛选标记基因组氨酸合成酶基因HIS3、色氨酸合成酶基因TRP1和潮霉素抗性基因HphMX4；其中，端粒TEL序列源自马克斯克鲁维酵母或四膜虫；含四膜虫来源端粒的酵母人工染色体载体核苷酸序列为SEQ ID No.1所示，含马克斯克鲁维酵母来源端粒的酵母人工染色体载体核苷酸序列为SEQ ID No.2所示。3.根据权利要求2所述的马克斯克鲁维酵母重组工程菌株，其特征在于，步骤(3)中，所述马克斯克鲁维酵母重组表达载体，含酵母自主复制序列、菊粉酶启动子、所述糖化酶基因、菊粉酶终止子和筛选标记基因的元件。4.根据权利要求3所述的马克斯克鲁维酵母重组工程菌株，其特征在于，步骤(3)中，所述马克斯克鲁维酵母表达载体为pUKDN132。5.根据权利要求4所述的马克斯克鲁维酵母重组工程菌株，其特征在于，步骤(3)中，所述糖化酶基因为食腺嘌呤芽生葡萄孢酵母糖化酶BadGLA，其核苷酸序列特征如SEQ ID No.3所示，氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。6.根据权利要求5所述的马克斯克鲁维酵母重组工程菌株，其特征在于，构建的马克斯克鲁维酵母人工染色体，记为YAC，将马克斯克鲁维酵母来源或毕赤酵母来源的二硫键异构途径基因克隆到人工染色体上，获得“YAC
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二硫键异构途径”，含有毕赤酵母来源的二硫键异构途径命名为YAC
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二硫键异构P5、YAC
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二硫键异构P7；含有马克斯克鲁维酵母来源的二硫键异构途径命名为YAC
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二硫键异构K5。7.如权利要求1
‑
6之一所述的马克斯克鲁维酵母重组工程菌株在高效表达糖化酶的应用。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，具体步骤为：1)在不改变氨基酸序列的前提下优化食腺嘌呤芽生葡萄孢酵母的糖化酶BadGLA基因的密码子；2)将优化的糖化酶基因序列插入至pUKDN132载体SpeⅠ和NotⅠ位点，获得糖化酶重组表达载体pUKDN132
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BadGLA；然后分别转入马克斯克鲁维酵母菌株FIM1/Lin Te_TEL
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【专利技术属性】
技术研发人员：吕红，周峻岗，余垚，吴萍萍，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：
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