【技术实现步骤摘要】
单克隆抗体可变区基因高通量测序的方法及其所用组合物与试剂盒
[0001]本专利技术涉及包括核酸的测定与检测领域中单克隆抗体可变区基因高通量测序的方法及其所用组合物与试剂盒。
技术介绍
[0002]杂交瘤细胞技术是应用最广泛且最成熟的抗体制备技术平台。杂交瘤细胞是小鼠骨髓瘤细胞和B淋巴细胞融合而成的细胞。它既具有骨髓瘤细胞无限繁殖的特性，又具有淋巴细胞分泌特异性抗体的能力。尽管杂交瘤细胞具有永生化的特性，但仍然存在抗体分泌量下降或丢失的风险，同时细胞培养过程中的污染或储存细胞不当也会导致抗体的丢失。如果通过测序得到抗体可变区序列，将其构建到表达载体中，通过重组表达即可获得相应抗体。因此，通过测序获得抗体可变区序列是非常重要的，它使得抗体能够以碱基序列的形式进行保存。
[0003]现有的抗体可变区测序是应用一代测序技术。一代测序是Sanger等在20世纪70年代中期专利技术的DNA末端终止法测序技术，通过在DNA聚合酶、模板、放射性同位素标记的引物、dNTP和ddNTP的作用下发生延伸反应。由于ddNTP的存在，会形成长度不一的DNA延伸片段，然后采用平板凝胶电泳，用4条电泳道来分离4个反应的所得产物，便可以按顺序读出相应的DNA序列。第一代的Sanger测序技术的优点是:测序读长长，测序用时短，具有较高的准确性等特点。
[0004]抗体测序过程首先提取杂交瘤细胞RNA，逆转录为cDNA。以cDNA为模板，使用特异性引物扩增抗体可变区序列，将可变区序列进行一代测序。应用一代测序技术虽然可以满足抗体测序需求...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.单克隆抗体可变区基因高通量测序的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：1)获取N种杂交瘤细胞的cDNA，所述N种杂交瘤细胞中每种杂交瘤细胞均分泌一种单克隆抗体，所述N为大于等于2的自然数；2)以所述每种杂交瘤细胞的cDNA为模板，分别用重链可变区基因引物组合物和轻链可变区基因引物组合物进行PCR扩增每种杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体的重链可变区基因和轻链可变区基因，得到每种杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体的重链可变区基因PCR产物和每种杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体的轻链可变区基因PCR产物；将N种杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体的重链可变区基因PCR产物混合进行测序，获得N种杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体的重链可变区基因PCR产物测序结果；将N种杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体的轻链可变区基因PCR产物混合进行测序，获得N种杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体的轻链可变区基因PCR产物测序结果；所述重链可变区基因引物组合物由重链可变区基因上游引物和重链可变区基因下游index引物组成，重链可变区基因下游index引物由N种引物组成，每种引物的5
’
端均含有Barcode序列，其余为重链可变区基因特异区段，每种重链可变区基因下游index引物的Barcode序列均不同；所述轻链可变区基因引物组合物由轻链可变区基因上游引物和轻链可变区基因下游index引物组成，轻链可变区基因下游index引物由N种引物组成，每种引物的5
’
端均含有所述Barcode序列，其余为轻链可变区基因特异区段，每种轻链可变区基因下游index引物的Barcode序列均不同；3）对2）获得的所述N种杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体的重链可变区基因PCR产物测序结果和N种杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体的轻链可变区基因PCR产物测序结果进行数据分析，分别得到每种杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体可变区基因的序列。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述barcode序列为用于区分不同杂交瘤细胞的单链DNA，所述barcode序列为如下68种单链DNA分子中的任一种：B1、5
’‑
TCGTCATG
‑3’
；B2、5
’‑
GTCAGTCC
‑3’
；B3、5
’‑
CGATTACG
‑3’
；B4、5
’‑
TCTACGAG
‑3’
；B5、5
’‑
TAACGTGC
‑3’
；B6、5
’‑
CGAAGGTT
‑3’
；B7、5
’‑
CACGCATT
‑3’
；B8、5
’‑
TACCAGGT
‑3’
；B9、5
’‑
TTACCGAG
‑3’
；B10、5
’‑
AGTCACCT
‑3’
；B11、5
’‑
TCGCATTC
‑3’
；B12、5
’‑
CATGGTAC
‑3’
；B13、5
’‑
CACGGACT
‑3’
；B14、5
’‑
CTGTAGCA
‑3’
；B15、5
’‑
AGAGCTTG
‑3’
；B16、5
’‑
AGCATAGC
‑3’
；B17、5
’‑
CCTACCAT
‑3’
；B18、5
’‑
GTCGTTGA
‑3’
；B19、5
’‑
TGCGTATC
‑3’
；B20、5
’‑
AGCTAACC
‑3’
；B21、5
’‑
GAACGGTA
‑3’
；B22、5
’‑
GGATTGTC
‑3’
；B23、5
’‑
TACCGTCT
‑3’
；B24、5
’‑
CGAGTATC
‑3’
；B25、5
’‑
TGTACGCT
‑3’
；B26、5
’‑
TCCTCTGA
‑3’
；B27、5
’‑
AGCGTATC
‑3’
；B28、5
’‑
TCATCACC
‑3’
；B29、5
’‑
GACAGTAC
‑3’
；B30、5
’‑
GTCCTTAC
‑3’
；B31、5
’‑
GGAGCAAT
‑3’
；B32、5
’‑
AGGAACAG
‑3’
；B33、5
’‑
CAGTGCTA
‑3’
；B34、5
’‑
CTAGCTAG
‑3’
；B35、5
’‑
TGCAAGCA
‑3’
；B36、5
’‑
CGCATCTA
‑3’
；B37、5
’‑
CGTATCTG
‑3’
；B38、5
’‑
GTAGACCT
‑3’
；B39、5
’‑
CGCCATTA
‑3’
；B40、5
’‑
ATGACACC
‑3’
；B41、5
’‑
CAAGTTGA
‑3’
；B42、5
’‑
TGCTGAAG
‑3’
；B43、5
’‑
ATGACCGT
‑3’
；B44、5
’‑
TGGCGAGA
‑3’
；B45、5
’‑
GCACTTCC
‑3’
；B46、5
’‑
GTTACCGA
‑3’
；B47、5
’‑
GACGTCAC
‑3’
；B48、5
’‑
GTTACAGC
‑3’
；B49、5
’‑
TCGATTGC
‑3’
；B50、5
’‑
GACGATCT
‑3’
；B51、5
’‑
TGACGCTA
‑3’
；B52、5
’‑
ATAACGCG
‑3’
；B53、5
’‑
GATTCACC
‑3’
；B54、5
’‑
GGCAAGTA
‑3’
；B55、5
’‑
GATCTAGC
‑3’
；B56、5
’‑
CATTGCGA
‑3’
；B57、5
’‑
GCTGTACA
‑3’
；B58、5
’‑
TAGCAGCT
‑3’
；B59、5
’‑
AGCGACAT
‑3’
；B60、5
’‑
CATTAGCC
‑3’
；B61、5
’‑
CATCTCCA
‑3’
；B62、
5
’‑
GTCATCGT
‑3’
；B63、5
’‑
GGACTTCA
‑3’
；B64、5
’‑
CAGGATCA
‑3’
；B65、5
’‑
GAACGATG
‑3’
；B66、5
’‑
CGACTTGC
‑3’
；B67、5
’‑
GATTCCGT
‑3’
和B68、5
’‑
CCGCTTAC
‑3’
。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重链可变区基因上游引物为特异结合于所述单克隆抗体的重链信号肽编码基因的单链DNA片段，所述重链可变区基因下游index引物为由所述barcode序列和重链可变区基因特异区段连接而成的单链DNA片段，所述重链可变区基因特异区段为特异结合于所述单克隆抗体的重链信号肽区及恒定区基因的DNA；所述轻链可变区基因上游引物为特异结合于所述单克隆抗体的轻链信号肽编码基因的单链DNA片段，所述轻链可变区基因下游index引物为由所述barcode序列和轻链可变区基因特异区段连接而成的单链DNA片段，所述轻链可变区基因特异区段为特异结合于所述单克隆抗体的轻链信号肽区及恒定区基因的DNA。4.根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于，所述引物组合物为A或B：A、所述杂交瘤为大鼠杂交瘤，所述重链可变区基因引物组合物由大鼠抗体重链可变区基因上游引物和大鼠重链可变区基因下游index引物组成，所述大鼠抗体重链可变区基因上游引物为核苷酸序列分别是序列表中序列17
‑
序列31的15种单链DNA；所述大鼠重链可变区基因下游index引物为核苷酸序列是序列表中序列65的单链DNA；所述轻链可变区基因引物组合物由大鼠轻链可变区基因上游引物和大鼠轻链可变区基因下游index引物组成，所述大鼠轻链可变区基因上游引物为核苷酸序列分别是序列表中序列1
‑
序列15的15种单链DNA；所述大鼠轻链可变区基因下游index引物为序列表中序列64的单链DNA；B、所述杂交瘤为小鼠杂交瘤，所述重链可变区基因引物组合物由小鼠抗体重链可变区基因上游引物和小鼠重链可变区基因下游index引物组成，所述小鼠抗体重链可变区基因上游引物为核...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈韬，吕爽，张玮祎，杜清一，周培源，
申请(专利权)人：苏州有诺真生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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