病人来源的移植瘤类器官模型PDXO的构建方法与应用技术

本发明专利技术涉及病人来源的移植瘤类器官模型PDXO的构建方法与应用。所述构建方法包括：利用PDX模型肿瘤组织块通过组织直接培养法或细胞培养扩增法得到病人来源的移植瘤类器官模型PDXO；组织直接培养法工艺包括：将肿瘤组织碎片置于类器官培养基中进行培养或者将所述肿瘤组织块切成的组织碎片包埋进基质凝胶胶滴内并浸没于类器官培养基内进行传代培养，得到病人来源的移植瘤类器官模型PDXO；细胞培养扩增法的工艺包括：将肿瘤组织块消化处理为肿瘤干性的单细胞或者细胞团并重悬于Matrigel培养基，然后进行Matrigel穹顶胶滴定型，经培养、换液、传代，得到病人来源的移植瘤类器官模型PDXO。型PDXO。型PDXO。

【技术实现步骤摘要】
病人来源的移植瘤类器官模型PDXO的构建方法与应用


[0001]本专利技术属于生物细胞/组织培养领域，具体涉及一种病人来源的移植瘤类器官模型PDXO的构建方法与应用。

技术介绍

[0002]实验模型对于疾病研究至关重要。传统意义上，癌症的临床前药效研究主要依赖体外培养的细胞/组织模型和接种人源肿瘤组织的小鼠移植瘤模型。其中，体外培养的细胞/组织模型是以已建立的可以无限分裂繁殖的肿瘤细胞系为素材，在相应的培养容器和培养基体系内进行体外培养而获得的实验模型，通过它们来研究癌症的发病机理，并利用它们来对不同诊疗手段的有效性进行研究和评估。接种人源肿瘤组织的小鼠移植瘤模型是以免疫缺陷小鼠作为载体，将人源的癌细胞(即CDX模型)或病人来源的肿瘤组织块(即PDX模型)嫁接到小鼠体内进行培养，从而获得相对应的癌症实验模型。该类模型可以帮助我们分析评价不同诊疗手段的有效性及预后情况。随着技术发展，已经可以进一步通过基因编辑改造等技术来实现对小鼠模型的进一步人源化改造，来更好地模拟病人体内的真实情况。
[0003]癌症作为一种高度异质性、高度个性化的系统性疾病。随着对癌症研究和攻略的深入，“精准化”、“个性化”、“更高临床相关性”等要求被提出并强调，这对于癌症相关的实验模型提出了更高的要求。对于以细胞/组织培养技术为基础的体外实验模型而言，目前已建立并在市场上流通使用的细胞系数量大约只有几千种，而将病人来源的肿瘤组织转化培养为可以无限分裂增殖的细胞系成功率低。尽管目前可以采取不同的培养或改造技术(比如2D/3D培养、抗性诱导、细胞融合、基因改造等)来进一步丰富体外细胞系的种类和数量的规模，并提高其临床相关性，但这样的数量规模与世界上癌症病人的数量规模相比还远远不够。具体而言，其规模的丰富程度、临床相关性指标等依然需要提高，以达到实验模型对病人真实疾病特征的准确描述，从而获得更加准确的数据结果来指导后续研发。另一方面，以CDX和PDX动物模型为基础的体内实验，虽然在一定程度上可以弥补体外实验模型的局限，提供更高的临床相关性和对疾病的更真实的模拟，但因其模型搭建周期长、成本高、不适用于快速高通量筛选实验等问题，导致其依然无法完全取代体外实验。

技术实现思路

[0004]针对上述问题，本专利技术旨在提供一种病人来源的移植瘤类器官模型PDXO的构建方法与应用。
[0005]第一方面，本专利技术提供了一种病人来源的移植瘤类器官模型PDXO的构建方法，所述构建方法包括：从PDX模型提取分离肿瘤组织块并利用组织块通过组织直接培养法或者细胞培养扩增法得到所述病人来源的移植瘤类器官模型PDXO；所述组织直接培养法的工艺包括：将肿瘤组织块切成组织碎片并置于类器官培养基中进行培养，或者将所述肿瘤组织块切成的组织碎片包埋进基质凝胶胶滴内并浸没于类
器官培养基内进行传代培养，得到所述病人来源的移植瘤类器官模型PDXO；所述细胞培养扩增法的工艺包括：将肿瘤组织块消化处理为肿瘤干性的单细胞或者细胞团并重悬于Matrigel培养基，然后将Matrigel悬液滴入孔板孵育进行Matrigel穹顶胶滴定型，经培养、换液、传代，得到所述病人来源的移植瘤类器官模型PDXO。
[0006]较佳地，所述类器官培养基的组分包括：杜式改良Eagle培养基/营养混合物F
‑
12、谷氨酰胺衍生物(1x)、B27(1x)、N2(1x)、青霉素/链霉素(1x)、Primocin、Noggin、EGF、Wnt3a、R
‑
spondins、A83
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01、Y
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27632、SB202190、N
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乙酰
‑
L
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半胱氨酸、烟酰胺。
[0007]较佳地，所述组织直接培养法的工艺中，控制所述肿瘤组织块与类器官培养基的用量比为0.1
‑
1.0g:5
‑
50mL。
[0008]较佳地，所述组织直接培养法的工艺中，培养代数>10代。
[0009]较佳地，所述细胞培养扩增法的工艺中，采用胶原蛋白酶、TrypLE两步消化肿瘤组织块得到肿瘤干性的单细胞或者细胞团。
[0010]较佳地，采用胶原蛋白酶、TrypLE两步消化肿瘤组织块的工艺为：将肿瘤组织块与胶原蛋白酶消化液混合进行消化，待观察到全部细胞以单细胞或多细胞团簇形式存在且混合溶液变浑浊时为止终止消化，离心处理，然后向离心后的沉淀内添加TrypLE消化液进行消化处理；所述胶原蛋白酶消化液组分包括：活性>250U/mL的CollagenaseIV，活性>250U/mL的DNase I，10μM Y
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27632，DMEM/F12培养基，Penicillin
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streptomycin(1x)。
[0011]较佳地，所述Matrigel悬液滴的细胞浓度控制在20,000
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100,000活细胞/μL。
[0012]较佳地，所述细胞培养扩增法的工艺中，每2
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4天进行一次换液，每7～10天进行一次传代。
[0013]第二方面，本专利技术提供了一种根据上述构建方法得到的病人来源的移植瘤类器官模型PDXO。
[0014]第三方面，本专利技术提供了一种上述病人来源的移植瘤类器官模型PDXO在高通量药敏筛选、PDXOX接种、体外免疫杀伤实验、病理样品制备中的应用。
[0015]有益效果本专利技术提供的PDXO技术可以提供新的体外实验模型，相较于传统的细胞/组织培养，PDXO模型具备更高的临床相关性，更好地保留了病人肿瘤组织内部的生物标志和病理特征，且适用于高通量筛选实验设计。在药物研发与临床前研究阶段，可以利用PDXO模型开展体外药效试验，对受试物疗效进行检测评估，为后续PDX动物模型的体内实验提供更准确的数据指导，进一步提升研究的准确性、时效性和性价比；本专利技术提供的PDXO体外实验模型，相较于动物模型，具备实验周期相对较短、成本相对较低、适用于高通量筛选等优势，进一步丰富癌症研究的实验模型，成为桥接体外实验、体内动物实验的又一个实验模型选项，为癌症研究提供更精确、临床更相关、性价比和时效性更高的实验结果；本专利技术提供的PDXO模型能够对生长缓慢或不易成瘤的PDX模型进行扩大培养，为PDX扩增建库提供新的选项。
附图说明
[0016]图1为病人来源的移植瘤类器官模型PDXO的构建方法流程示意图；图2为实施例1制备的人结肠癌移植瘤PDXO明场照片及尺寸随培养时间变化折线图；图3为本专利技术构建的四种不同的结肠癌PDXO明场照片；图4为本专利技术构建的肠癌类器官明场照片与HE病理组织染色照片；图5为利用本专利技术制备的人结肠癌移植瘤PDXO传入96孔板内的明场照片(上方)及其与不同浓度伊立替康(Irinotecan)和氟尿嘧啶(5
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Fluorouracil)共孵育72小时后明场的照片；图6为利用明场拍照(BF)和ATP本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种病人来源的移植瘤类器官模型PDXO的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：从PDX模型提取分离肿瘤组织块并利用组织块通过组织直接培养法或者细胞培养扩增法得到所述病人来源的移植瘤类器官模型PDXO；所述组织直接培养法的工艺包括：将肿瘤组织块切成组织碎片并置于类器官培养基中进行培养，或者将所述肿瘤组织块切成的组织碎片包埋进基质凝胶胶滴内并浸没于类器官培养基内进行传代培养，得到所述病人来源的移植瘤类器官模型PDXO；所述细胞培养扩增法的工艺包括：将肿瘤组织块消化处理为肿瘤干性的单细胞或者细胞团并重悬于Matrigel培养基，然后将Matrigel悬液滴入孔板孵育进行Matrigel穹顶胶滴定型，经培养、换液、传代，得到所述病人来源的移植瘤类器官模型PDXO。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述类器官培养基的组分包括：杜式改良Eagle培养基/营养混合物F
‑
12、谷氨酰胺衍生物(1x)、B27(1x)、N2(1x)、青霉素/链霉素(1x)、Primocin、Noggin、EGF、Wnt3a、R
‑
spondins、A83
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01、Y
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27632、SB202190、N
‑
乙酰
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L
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半胱氨酸、烟酰胺。3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，所述组织直接培养法的工艺中，控制所述肿瘤组织块与类器官培养基的用量比为0.1
‑
1.0g:5
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50mL。4.根据权利要求1
‑
3中任一项所述的构建方法，其特征在于，所述组织直接培养...

【专利技术属性】
技术研发人员：张巍钟，孙伟，曹保红，江奕霏，陈诚，
申请(专利权)人：美迪西普亚医药科技上海有限公司，
类型：发明
国别省市：