一种检测猴痘病毒的荧光定量PCR试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，提出了一种检测猴痘病毒的荧光定量PCR试剂盒，包括引物组，所述引物组包括靶标基因上游引物和靶标基因下游引物，所述靶标基因上游引物的核苷酸序列为如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列或如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列经一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入得到的具有相同功能的核苷酸序列；所述靶标基因下游引物的核苷酸序列为如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列或如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列经一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入得到的具有相同功能的核苷酸序列。通过上述技术方案，解决了相关技术中的检测猴痘病毒的方法特异性差的问题。测猴痘病毒的方法特异性差的问题。测猴痘病毒的方法特异性差的问题。

【技术实现步骤摘要】
一种检测猴痘病毒的荧光定量PCR试剂盒


[0001]本专利技术涉及生物
，具体的，涉及一种检测猴痘病毒的荧光定量PCR试剂盒。

技术介绍

[0002]猴痘（monkeypox）是一种由猴痘病毒（monkeypox virus，MPXV）引起的人畜共患病。MPXV最早于1958年在丹麦的哥本哈根被发现，从患病食蟹猴的痘液中成功分离，在1970年首例感染MPXV的病例发生在非洲刚果，从一名疑似天花患者的标本中分离得到。
[0003]猴痘病毒属痘病毒科（Poxviridae），有脂蛋白外膜。其基因组为线性双链DNA。在电子显微镜下观察，猴痘病毒为200～250nm的卵形或砖形颗粒。除了依赖宿主细胞的核糖体完成mRNA翻译外，猴痘病毒的基因组元件能指导完成所有的复制、转录、组装和出胞等过程。
[0004]猴痘病毒可从一种动物传给另一种动物，从动物传到人，也可发生人际传播。猴痘疫情通常发生在狩猎、杀戮、处理和食用森林猎物的人群中，患者大多有接触过野生动物或被其咬伤，或者食入过猴肉和松鼠肉，因而推测该病毒是经接触或经口传播。接触感染动物的血液、体液和伤口也能使人被传染。
[0005]常见的猴痘病毒实验室诊断方法有病毒分离培养、聚合酶链反应（PCR）、电子显微镜检查、免疫组织化学等方法。就这四种检测方法而言，各有利弊：病毒分离培养法可以产生纯的活病毒培养物，对物种进行明确分类，但是所需时间长，测定需要几天才能完成，对实验技术和实验条件要求较高；聚合酶链式反应可以使用患者的病变标本诊断活动性病例，但是要求较高的灵敏度，需要担心污染；电子显微镜检查可用于鉴定活检标本、结痂物质、水泡液或病毒培养物中的病毒颗粒，也可鉴别正痘病毒与疱疹病毒科，但仅在形态学上无法区分正痘病毒；免疫组织化学法可用于鉴定活检标本中的抗原，此技术可用于排除或识别其他可疑病原体，缺点是对猴痘病毒不具有特异性。
[0006]例如：申请号为CN200810234009.3的专利技术专利申请，公开了利用PCR法对猴痘病毒进行检测，优点在于方法经典，国际和国内标准齐全，仪器试剂成本较低，缺点是容易污染，操作繁琐，敏感性中等，存在非特异性扩增，当非特异条带与目的条带大小一样时无法区分。

技术实现思路

[0007]本专利技术提出一种检测猴痘病毒的荧光定量PCR试剂盒，解决了相关技术中的检测猴痘病毒的方法特异性差的问题。
[0008]本专利技术的技术方案如下：一种检测猴痘病毒的引物组，包括靶标基因上游引物和靶标基因下游引物，所述靶标基因上游引物的核苷酸序列为如下1）或2）：1）如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；
2）如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列经一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入得到的具有相同功能的核苷酸序列；所述靶标基因下游引物的核苷酸序列为如下3）或4）：3）如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；4）如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列经一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入得到的具有相同功能的核苷酸序列。
[0009]本专利技术还提出了一种检测猴痘病毒的引物探针组，包括靶标探针和所述引物组，所述靶标探针的核苷酸序列为如下5）或6）：5）如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列；6）如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列经一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入得到的具有相同功能的核苷酸序列。
[0010]作为进一步的技术方案，还包括内标上游引物、内标下游引物和内标探针，所述内标上游引物的核苷酸序列为如下7）或8）：7）如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列；8）如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列经一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入得到的具有相同功能的核苷酸序列；所述内标下游引物的核苷酸序列为如下9）或10）：9）如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列；10）如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列经一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入得到的具有相同功能的核苷酸序列；所述内标探针的核苷酸序列为如下11）或12）：11）如SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列；12）如SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列经一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入得到的具有相同功能的核苷酸序列。
[0011]本专利技术还提出了所述的引物组或所述的引物探针组在制备检测猴痘病毒的试剂、试剂盒或装置中的应用。
[0012]本专利技术还提出了一种检测猴痘病毒的荧光定量PCR试剂盒，包括所述的引物组或所述的引物探针组。
[0013]作为进一步的技术方案，所述试剂盒包括PCR反应液，所述PCR反应液包括所述引物组，或所述引物探针组，还包括DNA混合液。
[0014]作为进一步的技术方案，所述PCR反应液包括所述引物探针组，还包括DNA混合液；所述PCR反应液中，靶标上游引物、靶标下游引物、靶标探针、内标上游引物、内标下游引物、内标探针的终浓度分别为：0.4μmol/L、0.4μmol/L、0.2μmol/L、0.12μmol/L、0.12μmol/L、0.08μmol/L。
[0015]作为进一步的技术方案，还包括聚合酶；作为进一步的技术方案，所述聚合酶的体积浓度为2%。
[0016]作为进一步的技术方案，还包括阳性对照品和阴性对照品和内标对照品，所述阳性对照品的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示；所述内标标准品的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示；
所述阴性对照品为灭菌水。
[0017]本专利技术还提出了一种用于以非诊断目的的检测猴痘病毒的方法，包括以下步骤：S1. 提取待测样本中的核酸；S2. 使用所述的引物组对步骤S1得到的核酸进行荧光定量PCR检测，或使用所述的引物探针组对步骤S1得到的核酸进行荧光定量PCR检测，或使用所述的试剂盒对步骤S1得到的核酸进行荧光定量PCR检测；所述荧光定量PCR检测时，PCR扩增的反应程序为：UDG酶反应50℃，3min；预变性95℃，20s；变性95℃，3s；退火、延伸60℃，30s，在60℃进行荧光检测，变性和退火延伸进行45个循环。
[0018]本专利技术的工作原理及有益效果为：1. 本专利技术中，针对猴痘病毒设计特异性引物探针，并以RNase P作为内标，结合荧光定量PCR技术，使用特异性探针对定量分子进行识别，准确性高，同时靶序列由引物和探针双重控制，特异性好、假阳性低，解决了相关技术中的检测猴痘病毒的方法特异性差的问题。
[0019]2. 本专利技术中，检测猴痘病毒的试剂盒使用时，通过扩增曲线和Ct值直观地显示检测结果，缩短检测时间，同时降低了检测成本。
附图说明
[0020]下面结合附图和具体实施方式对本专利技术作进一步详细地说明。
[0021]图1为本专利技术试剂盒检测猴痘病毒阳性质粒的结果；图2为本专利技术试剂盒检测猴痘病毒的灵敏度结果；图中，从左到右依次为1
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104、1<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测猴痘病毒的引物组，其特征在于，包括靶标基因上游引物和靶标基因下游引物，所述靶标基因上游引物的核苷酸序列为如下1）或2）：1）如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；2）如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列经一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入得到的具有相同功能的核苷酸序列；所述靶标基因下游引物的核苷酸序列为如下3）或4）：3）如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；4）如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列经一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入得到的具有相同功能的核苷酸序列。2.一种检测猴痘病毒的引物探针组，其特征在于，包括靶标探针和如权利要求1所述的引物组，所述靶标探针的核苷酸序列为如下5）或6）：5）如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列；6）如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列经一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入得到的具有相同功能的核苷酸序列。3.根据权利要求2所述的检测猴痘病毒的引物探针组，其特征在于，还包括内标上游引物、内标下游引物和内标探针，所述内标上游引物的核苷酸序列为如下7）或8）：7）如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列；8）如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列经一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入得到的具有相同功能的核苷酸序列；所述内标下游引物的核苷酸序列为如下9）或10）：9）如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列；10）如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列经一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入得到的具有相同功能的核苷酸序列；所述内标探针的核苷酸序列为如下11）或12）：11）如SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列；12）如SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列经一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入得到的具有相同功能的核苷酸序列。4.根据权利要求1所述的引物组或如权利要求2或3所述的引物探针组在制备检测猴痘病毒的试剂、试剂盒或装置中的应用。5.一种检测猴痘病毒的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，包括如权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨海侠，李雨峰，陈立柱，李亚州，冯慧慧，
申请(专利权)人：保定佳瑞源生物芯片有限公司，
类型：发明
国别省市：