phi29DNA聚合酶突变体及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了phi29DNA聚合酶突变体及其制备方法与应用，涉及生物技术领域。该phi29DNA聚合酶突变体具有A1)至A2)中的任一种：A1)、如SEQ ID NO.2至SEQ ID NO.5任一项所示的氨基酸序列；A2)、在A1)所示的氨基酸序列的中间和/或N端或/和C端连接标签或DNA结合结构域得到的氨基酸序列。其针对非天然底物的延伸反应活性非常高，可用于针对非天然底物的滚环扩增和多重置换扩增等DNA扩增反应，并在测序等方面具有很好的应用前景。序等方面具有很好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
phi29 DNA聚合酶突变体及其制备方法与应用


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其是涉及phi29 DNA聚合酶突变体及其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]DNA聚合酶负责基因组的复制和维持，该作用对于准确地一代一代地传递遗传信息至关重要。链置换是指在DNA合成期间，聚合酶置换而不是降解所遇到的下游DNA的能力。在链置换复制期间，一次仅复制一条DNA链。链置换合成释放单链DNA，然后将其复制为双链DNA。phi29聚合酶是一种常见的DNA聚合酶，具有高持续合成、强链置换能力和高保真性等优点，在DNA扩增(包括滚环扩增和多重置换扩增)中得到广泛应用。但是phi29聚合酶针对非天然底物的扩增能力较弱，并保留外切酶活性，导致其不适用于需要进行非天然底物扩增的应用场景。

技术实现思路

[0003]本专利技术旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术提出phi29 DNA聚合酶突变体，其针对非天然底物的延伸反应活性非常高。
[0004]本专利技术还提供与上述phi29 DNA聚合酶突变体相关的生物材料。
[0005]本专利技术还提供一种酶制剂。
[0006]本专利技术还提供上述phi29 DNA聚合酶突变体的制备方法。
[0007]本专利技术还提供一种对模板DNA进行扩增或测序的方法。
[0008]本专利技术还提供上述phi29 DNA聚合酶突变体、生物材料或酶制剂相关的应用。
[0009]根据本专利技术的第一方面实施例的一种phi29 DNA聚合酶突变体，所述phi29 DNA聚合酶突变体具有A1)至A2)中的任一种：
[0010]A1)、如SEQ ID NO.2至SEQ ID NO.5任一项所示的氨基酸序列；
[0011]A2)、在A1)所示的氨基酸序列的中间和/或N端或/和C端连接标签得到的氨基酸序列。
[0012]根据本专利技术实施例的phi29 DNA聚合酶突变体，至少具有如下有益效果：
[0013]实施例的phi29 DNA聚合酶突变体针对非天然底物的延伸反应活性非常高，链置换能力强，保真性高，可用于针对非天然底物的滚环扩增和多重置换扩增等DNA扩增反应，且在测序等方面具有很好的应用前景。
[0014]根据本专利技术的一些实施例，A2)中，所述phi29 DNA聚合酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
[0015]根据本专利技术的一些实施例，所述phi29 DNA聚合酶突变体还可以具有如A1)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个残基获得的氨基酸序列，且功能与A1)所示的氨基酸序列功能相同或相似。其与A1)所示的氨基酸序列具有至少90％同一性。例如：可以为95％。
[0016]根据本专利技术的一些实施例，所述标签包括利于phi29 DNA聚合酶突变体的溶解、纯化和检测的标签中的至少一种。可以理解的是，本专利技术的phi29 DNA聚合酶突变体可以包含一个或多个标签；多个标签可以包含多个相同标签的组合，也可以为多个不同标签的组合。例如：利于phi29 DNA聚合酶突变体溶解的标签包括但不限于nus标签或麦芽糖结合蛋白；利于phi29 DNA聚合酶突变体纯化的标签包括但不限于strep标签、His标签、GST标签、pelB信号序列或ompA信号序列；利于phi29 DNA聚合酶突变体检测的标签包括但不限于辣根过氧化物酶(HRP)、β
‑
半乳糖苷酶、萤光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、HcRed、DsRed或青色荧光蛋白(CFP)。所述标签具体可以为strep标签。
[0017]根据本专利技术的第二方面实施例的与本专利技术第一方面实施例中所述的phi29 DNA聚合酶突变体相关的生物材料，所述生物材料为B1)至B4)中的任一种：
[0018]B1)、编码本专利技术第一方面实施例中所述的phi29 DNA聚合酶突变体的核酸分子；
[0019]B2)、含有B1)所述核酸分子的表达盒；
[0020]B3)、含有B1)所述核酸分子或B2)所述表达盒的重组载体；
[0021]B4)、含有B1)所述核酸分子、B2)所述表达盒或B3)所述重组载体的重组生物细胞。
[0022]根据本专利技术的一些实施例，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.8至SEQ ID NO.12任一项所示。
[0023]根据本专利技术的一些实施例，所述表达盒是指能够在宿主细胞中表达所述phi29 DNA聚合酶突变体的DNA。该DNA不但可包括启动所述phi29 DNA聚合酶突变体基因转录的启动子，还可包括终止所述蛋白质基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。
[0024]根据本专利技术的一些实施例，载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。具体可以为PET
‑
28a载体。
[0025]根据本专利技术的一些实施例，所述重组载体可以为在所述载体的多克隆位点插入编码所述phi29 DNA聚合酶突变体的核酸分子得到的重组载体。
[0026]根据本专利技术的一些实施例，生物细胞包括原核细胞和真核细胞。所述原核细胞包括细菌或藻。所述真核细胞包括真菌、哺乳动物细胞或昆虫细胞。其中，所述细菌可以为大肠杆菌，如大肠杆菌BL21(DE3)。所述重组生物不包含生殖材料。
[0027]根据本专利技术的一些实施例，所述重组生物细胞为向生物细胞中导入B1)所述核酸分子、B2)所述表达盒或B3)所述重组载体，得到的重组生物细胞。具体可以为向大肠杆菌BL21(DE3)中导入重组载体得到的重组大肠杆菌。
[0028]根据本专利技术的第三方面实施例的一种酶制剂，包括本专利技术第一方面实施例中所述的phi29DNA聚合酶突变体。
[0029]根据本专利技术的一些实施例，所述酶制剂可用于针对非天然底物的延伸反应。所述延伸反应包括但不限于DNA扩增或DNA测序。
[0030]根据本专利技术的第四方面实施例的本专利技术第一方面实施例中所述的phi29 DNA聚合酶突变体的制备方法，包括：
[0031]将本专利技术第一方面实施例中所述的phi29 DNA聚合酶突变体的编码基因导入生物细胞中，使所述编码基因得到表达，得到所述phi29 DNA聚合酶突变体。
[0032]根据本专利技术的一些实施例，所述生物细胞包括原核细胞和真核细胞。
[0033]根据本专利技术的一些实施例，所述原核细胞包括细菌或藻。其中，所述细菌可以为大肠杆菌，如大肠杆菌BL21(DE3)。
[0034]根据本专利技术的一些实施例，所述真核细胞包括真菌、哺乳动物细胞或昆虫细胞。
[0035]根据本专利技术的第五方面实施例的一种对模板DNA进行扩增或测序的方法，包括：以下步骤：
[0036]采用本专利技术第一方面实施例中所述的phi29 DNA聚合酶突变体对模板DNA进行扩增或测序。
[0037]根据本专利技术的一些实施例，具体可以包括以下步骤：
[0038]将所述phi29 DNA聚合酶突变体、模板DNA和引物的复本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种phi29 DNA聚合酶突变体，其特征在于，所述phi29 DNA聚合酶突变体具有A1)至A2)中的任一种：A1)、如SEQ ID NO.2至SEQ ID NO.5任一项所示的氨基酸序列；A2)、在A1)所示的氨基酸序列的中间和/或N端或/和C端连接标签或DNA结合结构域得到的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的phi29 DNA聚合酶突变体，其特征在于，A2)中，所述phi29DNA聚合酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。3.与权利要求1或2所述的phi29 DNA聚合酶突变体相关的生物材料，其特征在于：所述生物材料为B1)至B4)中的任一种：B1)、编码权利要求1或2所述的phi29 DNA聚合酶突变体的核酸分子；B2)、含有B1)所述核酸分子的表达盒；B3)、含有B1)所述核酸分子或B2)所述表达盒的重组载体；B4)、含有B1)所述核酸分子、B2)所述表达盒或B3)所述重组载体的重组生物细胞。4.根据权利要求3所述的生物材料，其特征在于，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.8至SEQ ID NO.1...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯伟，林武，叶作城，何筠，田晖，伊戈尔，
申请(专利权)人：安序源生物科技深圳有限公司，
类型：发明
国别省市：