产四角霉素的工程菌及其构建与应用制造技术

本发明专利技术公开了一种产四角霉素的工程菌及其构建与应用。本发明专利技术利用强启动子驱动寝屋川链霉菌中调控基因ovmZn和ovmWn的高表达，构建了重组工程菌株Sne/pZWn；或者，利用强启动子驱动二者的同源基因，包括圈卷产色链霉菌中调控基因ovmZ和ovmW在寝屋川链霉菌中的高表达，构建了重组工程菌株Sne/pZW。这些工程菌株均能使原本沉默的基因簇表达，激活了四角霉素的生物合成，为四角霉素的开发和应用奠定了基础。础。

【技术实现步骤摘要】
产四角霉素的工程菌及其构建与应用


[0001]本专利技术涉及基因工程和微生物制药领域，具体地说，涉及一种产四角霉素的工程菌及其构建与应用。

技术介绍

[0002]链霉菌是一类在土壤中广泛存在的革兰氏阳性细菌，属于原核生物界、厚壁菌门、放线菌纲、放线菌目和链霉菌属。除了具有复杂的形态发育分化周期外，链霉菌还能够产生种类繁多的次级代谢产物，这些次级代谢产物是抗生素、抗癌药物、免疫抑制剂、酶抑制剂、色素和其他生物活性物质等的重要来源，在医药、工业、农业等方面具有重要的应用价值。
[0003]链霉菌的染色体呈线性排列，GC含量较高，且基因组较大(8
‑
10Mb)。除了含有初级代谢相关的基因外，链霉菌基因组中还存在大量与次级代谢产物生物合成相关的基因，这些基因往往成簇排列。在实验室培养条件下，链霉菌中大多数次级代谢产物生物合成基因簇处于沉默状态。激活这些沉默的基因簇是发掘新结构、新活性天然产物的重要途径。
[0004]链霉菌中次级代谢产物基因簇的表达往往受到严格的调控。通过高表达正调控基因或者抑制负调控基因的表达可以有效地激活某些沉默的次级代谢产物生物合成基因簇。例如，在圈卷产色链霉菌7100(Streptomyces ansochromogenes 7100)中，oviedomycin合成基因簇中的正调控基因ovmZ和ovm W由于受到转录抑制而不能启动oviedomycin的合成。通过高表达ovmZ和ovm W可以激活沉默的oviedomycin合成基因簇，从而获得具有抑制癌细胞活性的oviedomycin(参见文献Xu,J.,Zhang,J.,Zhuo,J.,Li,Y,,Tian,Y.,Tan H.Activation and molecular mechanism of a cryptic oviedomycin biosynthetic gene cluster via the disruption of a global regulatory gene,adpA,in Streptomyces ansochromogenes.Journal of Biological Chemistry,2017,292:19708
‑
19720)。
[0005]四角霉素(Tetrangomycin)是链霉菌产生的抗生素，属于苯并蒽醌类抗生素。四角霉素不仅可以抑制金黄色葡萄球菌，还对多种癌细胞都具有抑制活性，是重要的药物先导化合物(参见文献Ribeiro,L.,Fumagalli,F.,Mello,R.B.,Froes,T.Q.,da Silva,M.,Villamizar G
ó
mez,S.M.,Barros,T.F.,Emery,F.S.,&Castilho,M.S.Structure
‑
activity relationships and mechanism of action of tetrangomycin derivatives as inhibitors of Staphylococcus aureus staphyloxanthin biosynthesis.Microbial pathogenesis,2020,144:104
‑
127)。目前，有关构建可激活四角霉素产生或者提高四角霉素产量的重组工程菌方面的研究鲜有报道。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一种产四角霉素的工程菌及其构建与应用。
[0007]本专利技术构思如下：通过对寝屋川链霉菌中沉默的四角霉素生物合成基因簇中的调控基因ovmZn和ovm Wn进行序列分析，推测其可能是影响四角霉素基因簇表达的途径特异
性调控基因。通过引入强启动子驱动ovmZn和ovm Wn的高表达，在重组工程菌株发酵液中检测到了四角霉素的产生，实现了寝屋川链霉菌中四角霉素生物合成基因簇的激活。此外，在寝屋川链霉菌中引入强启动子驱动的来自圈卷产色链霉菌中的ovmZ和ovm W也可以实现四角霉素生物合成基因簇的激活。
[0008]为了实现本专利技术目的，第一方面，本专利技术提供产四角霉素工程菌的构建方法，增强寝屋川链霉菌(Streptomyces neyagawaensis)中的基因ovmZn和ovm Wn，获得的基因增强菌株即为产四角霉素工程菌。
[0009]本专利技术中，所述增强的途径可选自以下1)～5)，或任选的组合：
[0010]1)通过导入具有所述基因的质粒而增强；
[0011]2)通过增加染色体上所述基因的拷贝数而增强；
[0012]3)通过改变染色体上所述基因的启动子序列而增强；
[0013]4)通过将强启动子与所述基因可操作地连接而增强；
[0014]5)通过导入增强子而增强。
[0015]其中，基因ovmZn为编码如下蛋白(A)或(B)的基因：
[0016](A)由SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列组成的蛋白；
[0017](B)SEQ ID NO:4所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(A)衍生的蛋白。
[0018]基因ovm Wn为编码如下蛋白(a)或(b)的基因：
[0019](a)由SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列组成的蛋白；
[0020](b)SEQ ID NO:5所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(a)衍生的蛋白。
[0021]第二方面，本专利技术提供产四角霉素工程菌的构建方法，在寝屋川链霉菌(Streptomyces neyagawaensis)中高表达ovmZn和ovm Wn的同源基因，包括来自圈卷产色链霉菌(Streptomyces ansochromogenes)的基因ovmZ和ovm W，获得的重组菌即为产四角霉素工程菌。
[0022]其中，基因ovmZ为编码如下蛋白(A
′
)或(B
′
)的基因：
[0023](A
′
)由SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列组成的蛋白；
[0024](B
′
)SEQ ID NO:8所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(A
′
)衍生的蛋白。
[0025]基因ovm W为编码如下蛋白(a
′
)或(b
′
)的基因：
[0026](a
′
)由SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列组成的蛋白；
[0027](b
′
)SEQ ID NO:9所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(a
′
)衍生的蛋白。
[0028]进一步地，将强启动子驱动的基因ovmZn和ovm Wn或者其同源基因，通过质粒导入寝屋川链霉菌中或通过基因工程手段整合到寝屋川链霉菌染色体上。所述同源本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.产四角霉素工程菌的构建方法，其特征在于，增强寝屋川链霉菌(Streptomyces neyagawaensis)中的基因ovmZn和ovmWn，获得的基因增强菌株即为产四角霉素工程菌；或者，在寝屋川链霉菌中高表达ovmZn和ovmWn的同源基因，包括来自圈卷产色链霉菌(Streptomyces ansochromogenes)的基因ovmZ和ovmW，获得的重组菌即为产四角霉素工程菌；其中，基因ovmZn为编码如下蛋白(A)或(B)的基因：(A)由SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列组成的蛋白；(B)SEQ ID NO:4所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(A)衍生的蛋白；基因ovmWn为编码如下蛋白(a)或(b)的基因：(a)由SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列组成的蛋白；(b)SEQ ID NO:5所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(a)衍生的蛋白；基因ovmZ为编码如下蛋白(A
′
)或(B
′
)的基因：(A
′
)由SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列组成的蛋白；(B
′
)SEQ ID NO:8所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(A
′
)衍生的蛋白；基因ovmW为编码如下蛋白(a
′
)或(b
′
)的基因：(a
′
)由SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列组成的蛋白；(b
′
)SEQ ID NO:9所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(a
′
)衍生的蛋白。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述增强的途径选自以下1)～5)，或任选的组合：1)通过导入具有所述基因的质粒而增强；2)通过增加染色体上所述基因的拷贝数而增强；3)通过改变染色体上所述基因的启动子...

【专利技术属性】
技术研发人员：谭华荣，王凯，田宇清，张集慧，李金娥，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：