一种用于检测组织生理状态ROS水平的肝星状细胞分离与标记方法技术

本发明专利技术公开了一种用于检测组织生理状态ROS水平的肝星状细胞分离与标记方法，包括如下步骤：新鲜肝组织碎片化，酶液消化组织及ROS探针DCFH

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测组织生理状态ROS水平的肝星状细胞分离与标记方法


[0001]本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种用于检测组织生理状态ROS水平的肝星状细胞分离与标记方法。

技术介绍

[0002]活性氧基主要来源于线粒体呼吸链途径、细胞色素酶P450途径、NADPH氧化酶等途径。在细胞内参与多种信号转导途径，调控细胞转录、分化、增殖与存活等多种过程。在肝纤维化中，活性氧可参与肝星状细胞的增殖和凋亡调控，促进肝星状细胞增殖。枯否细胞产生的ROS可通过旁分泌途径激活肝星状细胞，其中H2O2会促进COL1A1和COL1A2启动子转录，从而促进CollagenⅠ合成。
[0003]DCFH
‑
DA是常用检测ROS的荧光探针，DCFH
‑
DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成不透膜的DCFH，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。检测DCF的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。然而，由于细胞中ROS水平的变化速度很快，离开组织微环境的细胞的ROS水平很快发生改变，因此目前没有直接检测组织细胞的真实ROS水平的方法。DCFH
‑
DA荧光探针也仅用于培养的细胞ROS的检测，不能直接反映细胞在动物组织的真实生理状态下ROS水平。
[0004]此外，现有的肝星状细胞提取大都采用肝脏灌注法来消化肝脏组织，这种方法提取肝星状细胞对实验技能有较高要求，经常因灌注失败而放弃实验，同时灌注时间加上酶解和分离的时间也较长，离开组织的细胞不仅活性下降，其ROS水平也发生了较大变化，不能反映其组织中的真实ROS状态。

技术实现思路

[0005]本专利技术目的在于克服现有技术缺陷，提供一种用于检测组织生理状态ROS水平的肝星状细胞分离与标记方法。
[0006]本专利技术的技术方案如下：
[0007]一种用于检测组织生理状态ROS水平的肝星状细胞分离与标记方法，包括如下步骤：
[0008](1)将新鲜的肝脏组织切碎成小于1mm3的碎块，D
‑
Hanks缓冲液清洗后45
‑
55g离心0.5
‑
1.0min，弃上清，得沉淀；
[0009](2)将步骤(1)所得的沉淀用酶解液于36
‑
38℃进行避光酶解25
‑
35min，同步进行ROS的标记，该酶解液中含有终浓度为1％的IV型胶原酶、1％的链酶蛋白酶、20ug/mL的DNase I、2
‑
5％的FBS和4.5
‑
5.5μM的DCFH
‑
DA；
[0010](3)将步骤(2)所得的物料经68
‑
72μm的细胞筛过滤，加入EGTA溶液终止酶解，获得细胞悬液，接着将该细胞悬液经750
‑
850g离心4
‑
6min，弃上清，再用ACK裂解液悬浮细胞，
1.0
‑
2.0min后加入4
‑
6倍体积D
‑
Hanks缓冲液，再次750
‑
850g离心并弃上清，获得标记好DCFH
‑
DA的细胞沉淀；
[0011](4)在上述标记好DCFH
‑
DA的细胞沉淀中加入12％Nycodenz梯度分离液，充分混匀，上层液面沿壁小心加入含2％FBS的D
‑
Hanks缓冲液，1300
‑
1400g水平转子离心8
‑
15min，吸取分界液面的细胞，再加入4
‑
6倍体积D
‑
Hanks缓冲液洗涤细胞，550
‑
650g离心4
‑
6min，弃上清，得沉淀；
[0012](5)重悬步骤(4)所得的沉淀中的肝星状细胞，用流式细胞仪检测其ROS水平。
[0013]在本专利技术的一个优选实施方案中，所述步骤(1)为：将新鲜的肝脏组织置于预冷的D
‑
Hanks缓冲液中，刷洗组织表面血液后切碎成小于1mm3的碎块，然后用预冷的D
‑
Hanks缓冲液清洗后，于0
‑
4℃且45
‑
55g离心0.5
‑
1.0min，弃上清，得沉淀。
[0014]在本专利技术的一个优选实施方案中，所述步骤(2)中的酶解液经36
‑
38℃预热。
[0015]在本专利技术的一个优选实施方案中，所述D
‑
Hanks缓冲液的配制方法为：8.0g的NaCl、400mg的KCl、133mg的Na2HPO4·
12H2O、60mg的KH2PO4、35mg的NaHCO3用ddH2O溶解后，调节pH至7.2
‑
7.4，定容至1L，121℃，30min高压灭菌。
[0016]在本专利技术的一个优选实施方案中，所述酶解液由IV型胶原酶和链霉蛋白酶溶液、DNase I溶液、FBS和DCFH
‑
DA配制而成。
[0017]进一步优选的，所述IV型胶原酶和链霉蛋白酶溶液的配制方法为：50mg的IV型胶原酶、50mg的链霉蛋白酶用50mL的SC2溶液溶解，0.22μm滤头过滤，
‑
20℃保存；所述DNase I溶液的配制方法为100mg的DNase I溶解于50mL的GBSS
‑
B溶液中，0.22μm滤头过滤，
‑
20℃保存，使用时1：100稀释为工作液浓度20ug/mL。
[0018]更进一步优选的，所述SC2溶液的配制方法为：560mg的CaCl2·
2H2O、400mg的KCl、346.7mg的Na2HPO4·
12H2O、8g的NaCl、78mg的NaH2PO4·
H2O、350mg的NaHCO3溶解于1L ddH2O，0.22μm无菌滤器过滤，4℃保存。
[0019]更进一步优选的，所述GBSS
‑
B溶液的配制方法为：225mg的CaCl2·
2H2O、991mg的Glucose、370mg的KCl、30mg的KH2PO4、210mg的MgCl2·
6H2O、70mg的MgSO4·
7H2O、172mg的Na2HPO4·
12H2O、8g的NaCl、227mg的NaHCO3溶解于1LddH2O，0.22μm滤头过滤，4℃保存。
[0020]在本专利技术的一个优选实施方案中，所述12％Nycodenz梯度分离液的配制方法为：6g的Nycodenz溶解于50mL的GBSS
‑
A溶液中，调整密度于1.055
‑
1.080g/mL之间，0.22μm滤头过滤，4℃保存；所述GBSS
‑
A溶液的配制方法为本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测组织生理状态ROS水平的肝星状细胞分离与标记方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)将新鲜的肝脏组织切碎成小于1mm3的碎块，D
‑
Hanks缓冲液清洗后45
‑
55g离心0.5
‑
1.0min，弃上清，得沉淀；(2)将步骤(1)所得的沉淀用酶解液于36
‑
38℃进行避光酶解25
‑
35min，同步进行ROS的标记，该酶解液中含有终浓度为1％的IV型胶原酶、1％的链酶蛋白酶、20ug/mL的DNase I、2
‑
5％的FBS和4.5
‑
5.5μM的DCFH
‑
DA；(3)将步骤(2)所得的物料经68
‑
72μm的细胞筛过滤，加入预冷的EGTA溶液终止酶解，获得细胞悬液，接着将该细胞悬液经750
‑
850g离心4
‑
6min，弃上清，再用ACK裂解液悬浮细胞，1.0
‑
2.0min后加入4
‑
6倍体积D
‑
Hanks缓冲液，再次750
‑
850g离心并弃上清，获得标记好DCFH
‑
DA的细胞沉淀；(4)在上述标记好DCFH
‑
DA的细胞沉淀中加入12％Nycodenz梯度分离液，充分混匀，上层液面沿壁小心加入含2％FBS的D
‑
Hanks缓冲液，1300
‑
1400g水平转子离心8
‑
15min，吸取分界液面的细胞，再加入4
‑
6倍体积D
‑
Hanks缓冲液洗涤细胞，550
‑
650g离心4
‑
6min，弃上清，得沉淀；(5)重悬步骤(4)所得的沉淀中的肝星状细胞，用流式细胞仪检测其ROS水平。2.如权利要求1所述的一种用于检测组织生理状态ROS水平的肝星状细胞分离与标记方法，其特征在于：所述步骤(1)为：将新鲜的肝脏组织置于预冷的D
‑
Hanks缓冲液中，刷洗组织表面血液后切碎成小于1mm3的碎块，然后用预冷的D
‑
Hanks缓冲液清洗后，于0
‑
4℃且45
‑
55g离心0.5
‑
1.0min，弃上清，得沉淀。3.如权利要求1所述的一种用于检测组织生理状态ROS水平的肝星状细胞分离与标记方法，其特征在于：所述步骤(2)中的酶解液经36
‑
38℃预热。4.如权利要求1所述的一种用于检测组织生理状态ROS水平的肝星状细胞分离与标记方法，其特征在于：所述D
‑
Hanks缓冲液的配制方法为：8.0g的NaCl、400mg的KCl、133mg的Na2HPO4·
12H2O、60mg的KH2PO4、35mg的NaHCO3用ddH2O溶解后，调节pH至7.2
‑
7.4，定容至...

【专利技术属性】
技术研发人员：石松林，魏永贵，冯娴，余杨，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：