鉴别月鳢性别的分子标记、引物、试剂盒、方法及应用技术

本申请涉及月鳢性别检测技术领域，具体公开了鉴别月鳢性别的分子标记、引物、试剂盒、方法及应用。该分子标记为月鳢雌雄差异的DNA序列。该鉴定月鳢性别方法包括以月鳢的基因组DNA为模板采用引物进行PCR反应，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳以检测PCR反应产物以鉴别待检月鳢性别。实施例提供的引物、试剂盒及方法不受个体发育时期、环境的影响，性别鉴定简便快捷，对样品的要求低，鉴定结果准确性高，从而克服其他方法操作较繁琐、耗时较长等缺点，尤其适合于对大样本进行快速鉴定。于对大样本进行快速鉴定。于对大样本进行快速鉴定。

【技术实现步骤摘要】
鉴别月鳢性别的分子标记、引物、试剂盒、方法及应用


[0001]本申请涉及月鳢性别检测
，具体涉及鉴别月鳢性别的分子标记、引物、试剂盒、方法及应用。

技术介绍

[0002]月鳢(Channa striata)隶属于鲈形目(Perciformes)，攀鲈亚目(Anabantoidei)，鳢科(Channidae)，鳢属(Channa)，俗称七星鱼、山花鱼、山斑鱼、张公鱼等。月鳢分布于我国长江以南地区和东南亚各国，是重要淡水经济鱼类之一，也是重要的水族观赏鱼。月鳢生命力强、生长速度快、养殖当年即可上市，且肉多刺少、味道鲜美，深受养殖者和消费者的喜爱。在人工繁育及选择育种过程中，为了获得优质的苗种必须做好亲鱼的雌雄筛选，为了建立家系，必须能准确鉴定月鳢的性别。在养殖过程中，珠江流域月鳢第一次性成熟需要一年时间，长江流域地区月鳢第一次性成熟需要两年时间，在性成熟前无法通过外观形态鉴定其性别，性成熟个体也只有在繁殖季节通过其所产配子类型才可准确鉴定其性别，极大限制了月鳢人工繁育和良种培育进程。开发月鳢性别特异分子标记，建立快速鉴定月鳢遗传性别的分子方法是控制雌雄亲本性别比例、鉴定性染色体、研究性别决定和性染色体进化机制的重要手段，对月鳢的养殖和育种具有重要的意义。
[0003]目前，月鳢仍然没有明确的性别决定机制报道，尚未确定是否存在异形性别染色体，无法从细胞学角度鉴定其遗传性别。在月鳢胚胎和幼体阶段雌雄鱼形态上几乎没有区别，因此性成熟前的阶段无法通过外表形态鉴定其性别。这些问题的存在给育种、养殖及相关的遗传学基础研究带来很大的困扰，尤其是性别决定分子机制研究。月鳢性别特异分子标记筛选和遗传性别鉴定研究，不仅对月鳢遗传学相关的研究，而且对开展单性育种与养殖从而提高鱼产量、增加水产养殖收益都有着非常重要的意义。然而，目前国内外尚未见月鳢性别分子标记的报道。因此，开发一种可以准确鉴别其遗传性别的分子标记，发掘月鳢性别特异分子标记，利用分子生物学方法准确分辨、且可以在养殖场现场应用的月鳢遗传性别快速鉴定的分子技术成为月鳢养殖产业中亟待攻克的重要课题。

技术实现思路

[0004]本专利技术通过月鳢基因组测序，雌、雄鱼重测序结合全基因组关联分析(GWAS)和雌雄群体分化指数(Fst)分析，定位月鳢性别决定区，筛选了月鳢雄性特异的DNA序列，并设计性别特异分子标记应用到月鳢遗传性别鉴定。
[0005]为此，本申请实施例至少公开了以下技术方案：
[0006]第一方面，实施例公开了鉴别月鳢性别的分子标记，所述分子标记包括于月鳢3号染色体3000917～3001201nt区域发生Indel位点形成的雌雄差异序列，所述月鳢雌雄差异序列如SEQ ID NO.1所示。
[0007]第二方面，实施例公开了鉴别月鳢性别的分子标记引物，包括如SEQ ID NO.2所示的DNA分子和如SEQ ID NO.3所示的DNA分子。
[0008]第三方面，实施例公开了一种核酸分子，由第二方面所述的分子标记引物经PCR扩增而成，所述核酸分子的基因型与所述月鳢性别关联。
[0009]第四方面，实施例公开了一种试剂盒，包括第二方面所述的分子标记引物。
[0010]第五方面，实施例公开了一种鉴定月鳢性别的方法，其包括如下步骤：
[0011]取待检月鳢的基因组DNA样品；
[0012]以所述基因组DNA为模板，采用如权利要求3所述的引物进行PCR反应；
[0013]检测所得PCR反应产物以进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，若PCR反应产物中存在如如SEQ ID NO.4和5所示的两条目标条带，则对应待检月鳢为雄性；若若PCR反应产物中存在如如SEQ ID NO.4所示的一条目的条带，则对应待检月鳢为雌性。
[0014]第六方面，实施例公开了第一方面所述的分子标记、第二方面所述的分子标记引物、第三方面所述的核酸分子或第四方面所述的试剂盒在月鳢性别鉴定、筛选和/或育种中的应用。
附图说明
[0015]图1为本申请实施例提供的采用月鳢基因组测序、雌雄个体重测序结合性别GWAS分析结果。
[0016]图2为本申请实施例提供的采用月鳢基因组测序、雌雄个体重测序结合性别Fst分析结果。
[0017]图3为本申请实施例提供的采用引物对12个雄性月鳢DNA样本和12个雌性月鳢DNA样本的检测聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
具体实施方式
[0018]为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。本申请中未详细单独说明的试剂均为常规试剂，均可从商业途径获得；未详细特别说明的方法均为常规实验方法，可从现有技术中获知。
[0019]为迅速鉴别月鳢，应缩短月鳢亲鱼繁育、家系建立及控制养殖群体的雌雄性别比例的时间，减少成本，本申请专利技术人利用重测序结合月鳢基因组测序，通过GWAS分析筛选到月鳢雌雄差异的DNA片段(SEQ ID NO.1)，建立了月鳢遗传性别鉴定的分子标记、分子标记引物、试剂盒、方法及应用，以快速、准确的鉴别月鳢遗传性别。
[0020]在月鳢雌雄差异的DNA片段的筛选实施例中，对一尾雄性月鳢进行基因组DNA提取，分别进行Illumina、Pacbio Hifi、HI
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C建库测序，然后使用Hifiasm 0.16.1(r375)、Juicer v1.6、3D
‑
DNA v201008等软件进行基因组从头组装与染色体挂载，获得月鳢雄性全基因组序列。提取雌雄月鳢基因组DNA，进行重测序文库构建与测序，测序深度至少15
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；对测序数据进行过滤之后，将重测序序列使用BWA mem v0.7.17比对到月鳢基因组中，使用picard v2.27.4标记重复序列，使用GATK v4.2.5进行SNP、InDel变异检测，使用GEMMA v0.98.5软件分析对性别进行GWAS分析(结果如图1)，使用VCFtools 0.1.16软件分析对雌雄组进行Fst分析(结果如图2)，筛选性别相关InDel位点，并提取该位点上下游DNA序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0021]为此，实施例公开了鉴别月鳢性别的分子标记，所述分子标记包括于月鳢3号染色体3000917～3001201nt区域发生Indel位点形成的雌雄差异序列，所述月鳢雌雄差异序列如SEQ ID NO.1所示。在一些实施例中，所述雄性月鳢于3号染色体3000917～3001201nt区域相对于所述雌性月鳢于3号染色体3000917～3001201nt区域插入了如SEQ ID NO.1所示的序列。
[0022]另外，实施例还公开了鉴别月鳢性别的分子标记引物，包括如SEQ ID NO.2所示的DNA分子和如SEQ ID NO.3所示的DNA分子。其中，“分子标记引物”是用来扩增包含鉴别月鳢性别的分子标记的核苷酸序列，例如包含上述Inde本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.鉴别月鳢性别的分子标记，所述分子标记包括于月鳢3号染色体3000917～3001201nt区域发生Indel位点形成的雌雄差异序列，所述月鳢雌雄差异序列如SEQ ID NO.1所示。2.根据权利要求1所述的分子标记，所述雄性月鳢于3号染色体3000917～3001201nt区域相对于所述雌性月鳢于3号染色体3000917～3001201nt区域插入了如SEQ ID NO.1所示的序列。3.鉴别月鳢性别的分子标记引物，包括如SEQ ID NO.2所示的DNA分子和如SEQ ID NO.3所示的DNA分子。4.一种核酸分子，由如权利要求3所述的分子标记引物经PCR扩增而成，所述核酸分子的基因型与所述月鳢性别关联。5.根据权利要求4所述的核酸分子，如SEQ ID NO.4和/或5所示。6.一种试剂盒，包括权利要求3所述的分子标记引物。7.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括DNA聚合酶、Mg

【专利技术属性】
技术研发人员：刘海洋，赵建，欧密，罗青，张新铖，费树站，陈昆慈，张晋，崔同心，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院珠江水产研究所，
类型：发明
国别省市：