镉污染生物标志物及检测方法技术

本发明专利技术提供了镉污染生物标志物及检测方法，涉及生物技术领域。本发明专利技术所述的镉污染生物标志物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，本发明专利技术还提供了镉污染的检测方法，所述的检测方法为通过检测上述生物标志物的表达量反应水体是否存在镉污染。利用本发明专利技术方法检测镉污染的灵敏度高，易于检测和分析，水体发生镉污染后，上述生物标志物的表达量发生显著变化，利用该变化可以有效检测环境中的镉污染。用该变化可以有效检测环境中的镉污染。用该变化可以有效检测环境中的镉污染。

【技术实现步骤摘要】
镉污染生物标志物及检测方法


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及镉污染生物标志物及检测方法。

技术介绍

[0002]镉（Cadmium）是毒性最强的重金属之一，重金属镉因其独特的理化特性及毒性效应而表现出高度的危害性和难治理性，已成为危害水生生物质量安全的主要因素。重金属镉通过水生动植物的富集作用，通过食物链进行传递，在藻类、虾、贝类等中逐渐富集，被重金属污染后的生物体被人类食用后，不容易被排除在外，导致人体内的重金属含量逐渐升高，从而对人体的神经系统、消化系统、免疫系统、分泌系统等造成严重影响。
[0003]目前水体中重金属检测方法主要包括比色法、原子荧光法、原子吸收法、气相和液相色谱法，上述的检测方法前期工作量较大、检测过程复杂，价格昂贵。随着技术的不断成熟，通过检测水体中的生物标志物，即可对水体中的重金属污染情况进行监测，提高了人类对重金属污染的监控能力。
[0004]目前，开发一种能够准确、快速检测水体中是否存在镉污染的生物标志物对于监测镉污染风险十分关键。红条毛肤石鳖（Acanthochitona rubrolineatus），又名海石鳖或八节毛，隶属于多板纲（Polyplacophora），毛肤石鳖科（Acanthochitonidae），毛肤石鳖属（Acanthochitona）。红条毛肤石鳖在水体中分布广泛，采用红条毛肤石鳖检测水体镉污染较为方便，并且红条毛肤石鳖有关基因的表达量与水体中镉含量具有明显相关性，可以较为准确地判断水体镉污染情况。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种镉污染生物标志物及检测方法，所述的检测方法为通过检测生物标志物的表达量反应水体是否存在镉污染，本专利技术方法检测镉污染的灵敏度高，易于检测和分析。
[0006]为实现上述目的，本专利技术的技术方案如下：一方面，本专利技术提供了一种镉污染生物标志物，所述镉污染生物标志物为ArWz
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3基因，ArWz
‑
3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0007]具体地，所述的基因的核苷酸序列为与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列具有90%以上的同源性，且编码相同功能蛋白质的序列。
[0008]进一步地，上述具有90%以上的同源性包括具有91%同源性、具有92%同源性、具有93%同源性、具有94%同源性、具有95%同源性、具有96%同源性、具有97%同源性、具有98%同源性、具有99%同源性、具有100%同源性。
[0009]在一些实施方式中，含有上述ArWz
‑
3基因的表达载体、细胞系、宿主菌或上述基因编码的蛋白可作为镉污染生物标志物。
[0010]又一方面，本专利技术提供了镉污染的检测方法，包括以下步骤：（1）提取待检测水体中红条毛肤石鳖的RNA；
（2）将RNA反转录成cDNA；（3）以cDNA为模板，以ArWz
‑
3基因为靶基因，检测ArWz
‑
3基因的表达量；（4）通过检测的ArWz
‑
3基因的表达量，判断待检测的水体中是否存在镉污染。
[0011]优选地，步骤（1）中红条毛肤石鳖的RNA提取包括以下步骤：1）将新鲜组织用液氮速冻，迅速转移至液氮预冷的研钵中，用研杵研磨，期间不断加入液氮，直至研磨成粉末状（无明显可见颗粒）。
[0012]2）将研磨成粉的样品50mg转移至离心管中，加入1mL RNA isolater，静置；待样品完全融化后，再继续吹打至裂解液透明。
[0013]3）将裂解液转移至离心管中，离心，吸取上清。
[0014]4）向上述裂解液中加入1/5体积的氯仿。剧烈震荡，成乳浊液，静置，离心。小心取出离心管。此时溶液分为三层：无色的水相（上层）、白色中间层以及红色的有机层（下层），小心吸取上层水相至一个新的离心管中。
[0015]5）加入等体积预冷的异丙醇，上下颠倒混匀，静置，离心，可见白色沉淀。
[0016]6）小心弃去上清，加入75%乙醇（无RNA酶水配制）。轻弹管底，使沉淀悬浮，并上下颠倒数次，室温静置3
‑
5min。
[0017]7）离心，弃去上清。
[0018]8）在洁净的环境中室温敞口干燥沉淀，不可过分干燥，否则会导致RNA难以溶解。
[0019]9）加入适量的无RNA酶水溶解沉淀，待完全溶解后，取少量检测，其余在
‑
85℃～
‑
65℃保存。
[0020]优选地，步骤3）、步骤4）、步骤5）、步骤7）中离心的转速为10000
‑
12000rpm，离心的时间为5
‑
10min；进一步地，所述的离心的转速为11200rpm，离心的时间为5min。
[0021]优选地，步骤2）中将RNA反转录成cDNA包括以下步骤：（1）去除基因组DNA反应：
[0022]（2）反转录反应：
[0023]优选地，所述的检测红条毛肤石鳖ArWz
‑
3基因的表达量的方法包括但不限于实时
荧光定量PCR、RNA测序。
[0024]进一步地，步骤（3）中采用实时荧光定量PCR检测红条毛肤石鳖ArWz
‑
3基因的特异性引物序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。
[0025]进一步地，步骤（3）中实时荧光定量PCR检测的内参基因为cytb基因。
[0026]进一步地，所述的内参基因的引物对的序列如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示。
[0027]进一步地，步骤（3）中所述的实时荧光定量PCR的反应体系为：
[0028]进一步地，步骤（3）中所述实时荧光定量PCR的反应程序为：95℃预变性30 min；95℃变性10 s，60℃延伸30 s，共40个循环；熔解曲线程序：95℃进行15 s，60℃进行60 s，95℃进行15 s。
[0029]优选地，步骤（4）中判断水体是否存在镉污染的方法为：当ArWz
‑
3基因的表达量为0.01
‑
1.5时，存在镉污染；当红条毛肤石鳖ArWz
‑
3基因的表达量大于1.5时，不存在镉污染。
[0030]进一步地，步骤（4）中判断水体是否存在镉污染的方法为：当ArWz
‑
3基因的表达量为0.01
‑
1.3时，存在镉污染；当红条毛肤石鳖ArWz
‑
3基因的表达量为7.0
‑
8.0时，不存在镉污染。
[0031]再进一步地，步骤（4）中判断水体是否存在镉污染的方法为：当ArWz
‑
3基因的表达量为0.03
‑
1.26时，存在镉污染；当红条毛肤石鳖ArWz
‑
3基因的表达量为7.53
‑
7.81时，不存在镉污染。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种镉污染生物标志物，其特征在于，所述镉污染生物标志物为ArWz
‑
3基因，ArWz
‑
3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。2.一种镉污染的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）提取待检测水体中红条毛肤石鳖的RNA；（2）将RNA反转录成cDNA；（3）以cDNA为模板，以ArWz
‑
3基因为靶基因，检测ArWz
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3基因的表达量；（4）通过检测的红条毛肤石鳖ArWz
‑
3基因的表达量，判断待检测水体中是否存在镉污染。3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，步骤（3）中检测ArWz
‑
3基因的表达量的方法选自RNA测序、实时荧光定量PCR中的一种。4.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述的ArWz
‑
3基因的特异性引物序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。5.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，步骤（3）中实时荧光定量PCR检测时的内参...

【专利技术属性】
技术研发人员：王绪敏，曲江勇，王丽君，刘秀梅，邢志凯，王爽，张伟华，
申请(专利权)人：烟台大学，
类型：发明
国别省市：