心肌成纤维细胞HCFC-MYOG及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种心肌成纤维细胞HCFC

【技术实现步骤摘要】
心肌成纤维细胞HCFC
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MYOG及其应用


[0001]本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种心肌成纤维细胞HCFC
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MYOG及其应用。

技术介绍

[0002]心肌成纤维细胞(cardiac fibroblast，CF)、心肌细胞、内皮细胞和血管平滑肌细胞是心脏的主要组成成分。研究表明，成人心肌成纤维细胞在心脏的占比约为20％，CF通过合成分泌胶原蛋白、纤连蛋白等细胞外基质成分，为心脏细胞群提供完整的网状支撑系统，在维持心脏结构、功能、生物化学和电机械信号传导中发挥重要作用。CF还是心脏纤维化的关键效应细胞，参与缺血性心肌病、扩张型心肌病、肥厚型心肌病、糖尿病心肌病等多种常见心血管疾病的病理进程。
[0003]心肌梗死(myocardial infarction，MI)是冠状动脉发生急性闭塞，由此造成闭塞血管相应供血区域的心肌组织细胞发生不可逆的坏死。心肌细胞作为终末分化细胞，在受到缺血缺氧损伤而坏死之后无法自行修复，取而代之的是发生纤维化而形成瘢痕组织，随后出现心脏重塑和逐步出现心功能不全。现代药物治疗在阻止心室重构和心力衰竭方面还十分有限，通过细胞移植替代或使心肌细胞再生的心脏细胞重建技术，为阻止心肌梗死后心室重构和充血性心衰进展提供了一种新的治疗策略。近年的研究表明，干细胞治疗虽然能促进心脏再血管化，但存在致瘤风险。在体外诱导干细胞分化为心肌谱系细胞，然后再移植到心脏组织中可能是规避这一风险更佳的选择。已有研究证实，在小鼠心梗区注射人源诱导多能干细胞衍生的心肌细胞(hiPSC
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CM)能够明显改善心梗小鼠的心脏功能，在心梗大鼠心梗部位移植hiPSC
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CM和内皮细胞共培养的细胞薄片也能改善心脏功能，但移植到心脏组织中的细胞存活率低是细胞疗法一直存在的问题，已经成为阻碍干细胞临床转化应用的瓶颈之一。
[0004]转录因子基因MYOG编码肌细胞生成素(Myogenin)蛋白，是生肌调节因子(MRFs)基因家族的成员之一。MRFs转录因子家族(包括Myod、Myf5、Mrf4和MYOG)在骨骼肌发生的每一个阶段都起着关键作用。该家族所有成员共同含有一个保守的螺旋
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环
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螺旋(bHLH)基序，可以与下游基因的E盒结合，从而激活下游肌肉特异性基因的表达。研究表明，MYOG通过控制、启动成肌细胞的融合和肌纤维的形成，而在肌肉分化过程中起关键作用。本公司前期报道了过表达MYOG基因能够抑制由血管紧张素II诱导的心肌细胞凋亡，MYOG基因与心肌成纤维细胞的关系尚未见报道。

技术实现思路

[0005]本专利技术通过在人心肌成纤维细胞(HCFC)中过表达MYOG基因，构建了一种心肌成纤维细胞HCFC
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MYOG，该细胞于2023年6月27日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：63588，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
[0006]本专利技术的心肌成纤维细胞HCFC
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MYOG的构建方法如下：
[0007]1、构建pCW
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MYOG载体；
[0008]2、包装慢病毒；
[0009]3、转染HCFC细胞并筛选；
[0010]5、用盐酸多四环素(Dox)诱导MYOG基因表达，Dox浓度为2μg/mL；
[0011]6、用qPCR、Western blot、免疫荧光法对HCFC
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MYOG细胞株进行鉴定；
[0012]7、用H2O2、CoCl2处理细胞，流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞死亡比例。
[0013]本专利技术表明，利用转录因子基因MYOG可提高心肌成纤维细胞(HCFC)对缺氧和氧化损伤的耐受性。
附图说明
[0014]图1为获得心肌成纤维细胞HCFC
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MYOG的技术流程图；
[0015]图2为qPCR检测的HCFC和HCFC
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MYOG中MYOG mRNA表达水平图；
[0016]图3为Western blot检测HCFC和HCFC
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MYOG中MYOG蛋白表达水平图；
[0017]图4为免疫荧光鉴定HCFC和HCFC
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MYOG中MYOG阳性细胞结果图，比例尺为50微米；
[0018]图5为模拟活性氧(H2O2)和缺氧损伤(CoCl2)条件下，HCFC
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MYOG细胞金额HCFC的细胞凋亡比例和死亡比例图，***，p<0.001；ns，无统计学差异；
[0019]图6为H2O2、CoCl2条件下HCFC
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MYOG共培养心肌细胞的细胞凋亡比例图。
具体实施方式
[0020]为让本领域的技术人员更加清晰直观的了解本专利技术，下面将结合附图，对本专利技术作进一步的说明。
[0021]实施例1：获得心肌成纤维细胞HCFC
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MYOG的细胞株
[0022]获得心肌成纤维细胞HCFC
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MYOG的技术流程如图1所示。
[0023]1.1慢病毒表达载体构建：用常规分子克隆方法将MYOG cDNA和一个嘌呤霉素抗性基因亚克隆到pCW
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Cas9
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Blast载体中(Addgene，83481)，取代原载体中的Cas9和Blast基因。
[0024]1.2慢病毒包装
[0025]1.2.1接种HEK293T细胞到6孔板中，用D10培养液(DMEM培养液+10％胎牛血清)进行培养，待细胞汇合度达到70％
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80％时进行转染。
[0026]1.2.2在转染前1h，弃去原来培养液，加入2mL/孔预热的无血清OptiMEM培养液。
[0027]1.2.3按照产品说明书的记载用Lipofectamine 2000试剂进行转染。将pCW
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MYOG(20μg)、pVSVg(10μg)(Addgene)、psPAX2(15μg)(Addgene)共转染HEK293T细胞。
[0028]1.2.4在6h后，将培养液更换成D10培养液(DMEM培养液+10％胎牛血清+1％BSA)。
[0029]1.2.5继续培养约60h后，取培养液于3000rpm、4℃离心10min，去除细胞残渣。
[0030]1.2.6用0.45μm低蛋白结合滤膜(Millipore Steriflip HV/PVDF)过滤上清液，去除细胞残渣。
[0031]1.2.7将含病毒的培养液按照体积比4:1与10％蔗糖缓冲液(50mM Tris
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Hcl，pH 7.4，100mM NaCl，0.5mM EDTA)，10000g、4℃离心4h。小心弃去上清液，离心管在吸水纸上沥干3min，加入1
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PBS重悬，<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.心肌成纤维细胞HCFC
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MYOG，该细胞于2023年6月27日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：63588。2.如权利要求1所述的心肌成纤维细胞HCFC
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MYOG在制备心肌细胞保护剂中的应用。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述心肌细胞死亡的因素包括缺氧或氧化损伤。4.如权利要求1所述的心肌成纤维细胞HCFC
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MYOG在制备治疗心肌梗死的...

【专利技术属性】
技术研发人员：林彬，孔维维，王萍，林泽斌，许恒，
申请(专利权)人：广东源心再生医学有限公司，
类型：发明
国别省市：