用于游离DNA全基因组测序的文库构建试剂盒及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于游离DNA全基因组测序的文库构建试剂盒及应用。所述文库构建试剂盒包括去磷酸化和末端修复用的酶组合物、去磷酸化和末端修复用的缓冲液、TOPO接头、连接缓冲液、PCR扩增引物和PCR扩增反应混合液，所述TOPO接头包括第一TOPO接头和第二TOPO接头，第一TOPO接头由第一双链核苷酸接头与牛痘拓扑异构酶I组装而成，第二TOPO接头由第二双链核苷酸接头与牛痘拓扑异构酶I组装而成。本发明专利技术提供的文库构建试剂盒能够实现游离DNA全基因组测序文库的简单、高效、低成本的制备，并且操作步骤简单，缩短文库制备时间，避免在制备过程中因繁琐操作步骤及多步纯化引起文库的大量损失，建库效率高。建库效率高。建库效率高。

【技术实现步骤摘要】
用于游离DNA全基因组测序的文库构建试剂盒及应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体的，本专利技术涉及一种文库构建试剂盒，尤其涉及用于游离DNA全基因组测序的文库构建试剂盒及其在构建游离DNA的全基因组测序文库中的应用。

技术介绍

[0002]在精准医疗时代下，基于循环肿瘤DNA(ctDNA)的液体活检因其无创性、便捷性、高重复性这些优于组织活检的特点，在癌症的早期筛查和诊断等方面具有巨大的潜能。ctDNA是游离DNA中来自肿瘤细胞的部分，携带着与癌症相关的分子特征，包括体细胞突变、拷贝数异常和DNA差异甲基化等，这些变异特征在肿瘤发展早期即可检测到。因此，ctDNA检测为癌症的早期筛查提供了一种非侵入性的方法，并已成为肿瘤研究领域的重大热点。早在1940年游离DNA被科学家首次发现以来被不断地应用于科学研究和临床应用中。大规模并行测序或所谓的下一代测序(NGS)技术的最新发展使游离DNA的检测具有很高的灵敏度和特异性。越来越多的证据表明，测序的广度将有可能替代测序的深度，以克服游离DNA片段少的限制。全基因组测序能够获得最全面的ctDNA遗传和表观遗传的变异信息，低覆盖度的游离DNA全基因组测序已能够提供广泛的癌症相关的CNV和核小体定位信息，进而能够实现肿瘤的分子分型和组织起源定位。虽然，游离DNA的全基因组测序极具潜能，但目前仍存在许多挑战，尤其是高背景的游离DNA中存在极低含量的ctDNA，这对于构建高质量的测序文库提出了挑战。
[0003]目前主流的游离DNA全基因组测序文库制备流程，采用末端修复和加A，依赖于T4 DNA连接酶进行接头连接，磁珠捕获片段后扩增获得游离DNA全基因组测序文库。或者通过随机连接再随机片段化并连接接头，扩增后得到测序文库。这些文库制备过程均涉及使用低效率的连接酶，制备过程中易产生接头二聚体，并造成游离DNA的连接效率低，操作步骤繁琐以及多步纯化均会引起文库的大量损失。

技术实现思路

[0004]本专利技术的主要目的在于提供一种用于游离DNA全基因组测序的文库构建试剂盒，以克服现有技术中的不足。
[0005]本专利技术的另一目的还在于提供一种构建游离DNA的全基因组测序文库的方法。
[0006]为实现前述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案包括：
[0007]本专利技术实施例提供了一种用于游离DNA全基因组测序的文库构建试剂盒，其包括：去磷酸化和末端修复用的酶组合物、去磷酸化和末端修复用的缓冲液、TOPO接头、连接缓冲液、PCR扩增引物和PCR扩增反应混合液，所述TOPO接头包括第一TOPO接头和第二TOPO接头，第一TOPO接头由第一双链核苷酸接头与牛痘拓扑异构酶I组装而成，第二TOPO接头由第二双链核苷酸接头与牛痘拓扑异构酶I组装而成。
[0008]在一些实施例中，所述第一双链核苷酸接头的序列从5
’
至3
’
依次包括第一通用序
列、第一随机分子标签序列、第一间隔序列、第一链分子标签序列、牛痘拓扑异构酶I识别位点和单链序列。
[0009]在一些实施例中，所述第一双链核苷酸接头由第一单链核苷酸与第二单链核苷酸退火合成，其中，所述第一单链核苷酸的序列如SEQ ID No.1所示，所述第二单链核苷酸的序列如SEQ ID No.2所示。
[0010]在一些实施例中，所述第二双链核苷酸接头的序列从5
’
至3
’
依次包括第二通用序列、第二随机分子标签序列、第二间隔序列、第二链分子标签序列、牛痘拓扑异构酶I识别位点和单链序列。
[0011]在一些实施例中，所述第二双链核苷酸接头由第三单链核苷酸与第四单链核苷酸退火合成，其中，所述第三单链核苷酸的序列如SEQ ID No.10所示，所述第四单链核苷酸的序列如SEQ ID No.11所示。
[0012]本专利技术实施例还提供了所述用于游离DNA全基因组测序的文库构建试剂盒于构建游离DNA的全基因组测序文库中的应用。
[0013]本专利技术实施例还提供了一种游离DNA的全基因组测序文库的构建方法，其包括：
[0014](1)提供前述用于游离DNA全基因组测序的文库构建试剂盒；
[0015]将游离DNA、所述试剂盒中的去磷酸化和末端修复用的酶组合物、去磷酸化和末端修复用的缓冲液混合进行连接反应，进行去磷酸化和末端修复，得到去磷酸化和末端修复产物；
[0016](2)将所述去磷酸化和末端修复产物、TOPO接头和连接缓冲液混合后进行TOPO接头连接反应，得到TOPO接头连接产物；
[0017](3)将所述TOPO接头连接产物、PCR扩增引物和PCR扩增反应混合液混合，经PCR扩增后得到扩增产物，得到游离DNA的全基因组测序文库。
[0018]与现有技术相比，本专利技术的有益效果至少包括：
[0019]本专利技术提供的用于游离DNA全基因组测序的文库构建试剂盒采用具有高效核酸连接效率的第一TOPO接头和第二TOPO接头对游离DNA进行连接，使得游离DNA能够被高效率捕获；本方法不易产生接头二聚体，使得游离DNA的全基因组测序文库制备效率大大提升，这将为全面检测ctDNA的基因突变、拷贝数变异、核小体定位信息提供保障。而且双端TOPO接头对游离DNA捕获的同时引入正负链分子标签和随机引物标签，能够有效过滤掉因PCR引入的碱基错配，从而能够分辨出真正的基因突变。此外，本专利技术对TOPO接头捕获的游离DNA采用PCR扩增使得初始微量游离DNA得到富集，同时引入测序接头，最终构建游离DNA全基因组测序文库。并且，本专利技术的操作步骤简单，避免了使用传统的依赖于T4 DNA连接酶的加A尾法接头连接，缩短了全基因组文库制备时间，避免在制备的过程中因繁琐的操作步骤以及多步纯化引起文库的大量损失，因此建库效率高。所述试剂盒试剂制备容易、成本低，可替代进口商用游离DNA全基因组文库制备试剂盒，在液体活检的临床应用方面具有良好的产业化前景。
附图说明
[0020]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本
专利技术中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0021]图1为本专利技术一典型实施方案中一种游离DNA全基因组测序文库构建方法的原理示意图。
[0022]图2为本专利技术一典型实施例中的最终测序文库纯化后进行Agilent 4150的检测结果图。
具体实施方式
[0023]鉴于现有技术中的不足，本案专利技术人经长期研究和大量实践，得以提出本专利技术的技术方案，其主要是提供一种游离DNA全基因组测序的文库构建试剂盒，能够实现游离DNA测序文库的简单、高效、低成本的制备，能够替代现有的进口商业化试剂盒。如下将对该技术方案、其实施过程及原理等作进一步的解释说明。
[0024]作为本专利技术实施例的一个方面，本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于游离DNA全基因组测序的文库构建试剂盒，其特征在于，包括：去磷酸化和末端修复用的酶组合物、去磷酸化和末端修复用的缓冲液、TOPO接头、连接缓冲液、PCR扩增引物和PCR扩增反应混合液，所述TOPO接头包括第一TOPO接头和第二TOPO接头，第一TOPO接头由第一双链核苷酸接头与牛痘拓扑异构酶I组装而成，第二TOPO接头由第二双链核苷酸接头与牛痘拓扑异构酶I组装而成。2.根据权利要求1所述的用于游离DNA全基因组测序的文库构建试剂盒，其特征在于，所述去磷酸化和末端修复用的酶组合物包括如下组分：浓度为0.05～0.1U/μL的小牛肠碱性磷酸酶、浓度为0.05～0.1U/μL的虾碱性磷酸酶、浓度为0.04～0.1U/μL的T4 DNA聚合酶、浓度为0.01～0.05U/μL的Klenow DNA聚合酶和浓度为0.005～0.05U/μL的Taq DNA聚合酶；和/或，所述去磷酸化和末端修复用的缓冲液包括如下组分：浓度为2～5mmol/L的ATP、浓度为50～100mmol/L的Tris
‑
HCl、浓度为1～10mmol/L的MgCl2、浓度为10～50mmol/L的DTT和浓度为1～2mmol/L的dNTP。3.根据权利要求1所述的用于游离DNA全基因组测序的文库构建试剂盒，其特征在于：所述第一双链核苷酸接头的序列从5
’
至3
’
依次包括第一通用序列、第一随机分子标签序列、第一间隔序列、第一链分子标签序列、牛痘拓扑异构酶I识别位点和单链序列；优选的，所述第一双链核苷酸接头由第一单链核苷酸与第二单链核苷酸退火合成，其中，所述第一单链核苷酸的序列如SEQ ID No.1所示，所述第二单链核苷酸的序列如SEQ ID No.2所示。4.根据权利要求3所述的用于游离DNA全基因组测序的文库构建试剂盒，其特征在于：所述第一单链核苷酸的第一通用序列的序列如SEQ ID No.3所示，第一随机分子标签序列为包含6～10个碱基的序列，所述第一单链核苷酸的第一间隔序列如SEQ ID No.4所示，所述第一单链核苷酸的第一链分子标签序列为包含4～12个碱基的序列，所述第一单链核苷酸的牛痘拓扑异构酶I识别位点的序列如SEQ ID No.5所示，所述第一单链核苷酸的单链序列如SEQ ID No.6所示；和/或，所述第二单链核苷酸中与所述第一单链核苷酸的第一通用序列互补配对的序列如SEQ ID No.7所示，所述第二单链核苷酸中与所述第一单链核苷酸的第一随机分子标签序列互补配对的序列为包含6～10个碱基的序列，所述第二单链核苷酸中与所述第一单链核苷酸的第一间隔序列互补配对的序列如SEQ ID No.8所示，所述第二单链核苷酸的链分子标签序列为包含4～12个碱基的序列，所述第二单链核苷酸中与所述第一单链核苷酸的牛痘拓扑异构酶I识别位点互补配对的序列如SEQ ID No.9所示。5.根据权利要求4所述的用于游离DNA全基因组测序的文库构建试剂盒，其特征在于：所述第二双链核苷酸接头的序列从5
’
至3
’
依次包括第二通用序列、第二随机分子标签序列、第二间隔序列、第二链分子标签序列、牛痘拓扑异构酶I识别位点和单链序列；优选的，所述第二双链核苷酸接头由第三单链核苷酸与第四单链核苷酸退火合成，其中，所述第三单链核苷酸的序列如SEQ ID No.10所示，所述第四单链核苷酸的序列如SEQ IDNo.11所示。6.根据权利要求5所述的用于游离DNA全基因组测序的文库构建试剂盒，其特征在于：所述第三单链核苷酸的第二通用序列的序列如SEQ ID No.12所示，第二随机分子标签序列为包含6～10个碱基的序列，所述第三单链核苷酸的第二间隔序列如SEQ ID No.13所示，所
述第三单链核苷酸的第二链分子标签序列为包含4～12个碱基的序列，所述第三单链核苷酸的牛痘拓扑异构酶I识别位点的序列如SEQ ID No.5所示，所述第三单链核苷酸的单链序列如SEQ ID No.6所示；和/或，所述第四单链核苷酸中与所述第三单...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑建萍，吕天琦，
申请(专利权)人：中国科学院宁波材料技术与工程研究所，
类型：发明
国别省市：