一种眼部递送改善视力的外泌体混合物的制备方法技术

本发明专利技术公开一种眼部递送改善视力的外泌体混合物的制备方法，包括以下步骤：S101：将人角膜缘干细胞和间充质干细胞分别培养，传代4次，并将其细胞培养基保存，用于分离外泌体；S102：使用超离心方法分离外泌体，并使用纳米颗粒跟踪分析(NTA)进行计数，混合物每mL含有2

【技术实现步骤摘要】
一种眼部递送改善视力的外泌体混合物的制备方法


[0001]本专利技术涉及生物
，特别涉及一种眼部递送改善视力的外泌体混合物的制备方法。

技术介绍

[0002]角膜表面的正常与稳定对于保持角膜透明和维持正常的生理功能极为重要，不仅是角膜和结膜之间的堤坝，更是角膜上皮再生的来源。角膜的缺陷主要是由创伤、细菌感染、化学性灼伤与隐形眼镜造成。据统计显示，全球约有1300万人患有影响视力的角膜损伤或疾病，并且每年亦诊断1500至200万件新发病例。角膜的缺陷可能导致一系列眼睛疾病，甚至会导致失明。
[0003]解决促进角膜损伤或其他眼组织损伤个体的眼瘢痕愈合和改善视力的技术问题，眼部损伤的传统治疗方法在促进组织再生和视力改善方面可能不那么有效。角膜缘干细胞(LimbalStemCells,LSCs)的发现是近几十年来眼科学最重要的进展之一。就目前而言，角膜缘干细胞的移植手术是治疗眼表疾病以及重建角膜结构最有效的治疗方式。体外培养角膜缘干细胞培养的标准方法是直接将角膜缘干细胞放置在停滞生长的滋养细胞(Feedercell)上共同培养。
[0004]人间充质干细胞(humanMSCs,hMSCs)是一类具有一定的自我复制更新和多向分化潜能的成体干细胞，广泛存在于胎儿和成人各组织中，如骨髓、脂肪、皮肤、牙髓、肌腱，以及新生儿附属组织，如脐带、胎盘、羊膜等等组织。除一定程度的分化潜能外，hMSCs还具有独特的免疫调控和组织再生功能，参与调控异常免疫反应、维护免疫平衡，帮助机体形成有利于病损组织细胞修复或再生的微环境，以促进损伤组织细胞的修复或再生，但其发挥作用的机制目前还不明确，最初认为脐带间充质干细胞植入人体后归巢到受损部位，进行细胞自我更新和定向分化，但后续研究表明移植的细胞大部分发生了凋亡，归巢到损伤部位的细胞和分化为靶细胞的数量有限，不能充分解释其组织修复现象，现在越来越多的研究认为脐带间充质干细胞是通过旁分泌机制分泌大量的细胞因子作用于受损部位，进而促进组织修复。
[0005]外泌体是一种能被机体内大多数细胞分泌的微小膜泡，具有脂质双层膜，直径大约为30
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150nm。外泌体广泛存在并分布于各种体液中，携带和传递重要的信号分子，形成了一种全新的细胞
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细胞间信息传递系统，影响细胞的生理状态并与多种疾病的发生与进程密切相关。随着有关外泌体研究越来越多，研究者发现它广泛参与了机体免疫应答、抗原呈递、细胞分化、肿瘤生长于侵袭等各种生物过程中。
[0006]外泌体是细胞分泌到细胞外的成分，量比较少。而本专利技术是开发一种专门设计用于眼部递送的外泌体混合物，该混合物利用了人类角膜缘干细胞衍生的外泌体和间充质干细胞衍生的外泌体的再生和免疫调节特性。通过使用该混合物，本专利技术寻求改善愈合过程，增强视力改善，并减少不良副作用的风险。

技术实现思路

[0007]本专利技术的主要目的是提供一种眼部递送改善视力的外泌体混合物的制备方法，该混合物含有来源于人角膜缘干细胞和间充质干细胞的外泌体，悬浮在水中作为载体培养基。通过结合两种干细胞衍生的外泌体的再生特性，这种混合物促进了协同效应，加速了愈合过程并改善了视力。
[0008]为实现上述目的，本专利技术提出的一种眼部递送改善视力的外泌体混合物的制备方法，包括以下步骤：
[0009]S101：将人角膜缘干细胞和间充质干细胞分别培养，传代4次，并将其细胞培养基保存，用于分离外泌体；
[0010]S102：使用超离心方法分离外泌体，并使用纳米颗粒跟踪分析(NTA)进行计数，混合物每mL含有2
×
10^9个外泌体，人角膜缘干细胞来源的外泌体与间充质干细胞来源的外泌体的比例为1:1。
[0011]优选地，在所述的S101中，人角膜缘干细胞的分离和培养方法包括：
[0012]S1011：培养液的配制：
[0013]基础培养基DMEM/F12内加入5ng/mL表皮生长因子、30ng/ml霍乱毒素、5μg/ml胰岛素、0.5mg/ml谷氨酰胺、20％胎牛血清、100IU/mL青霉素和100IU/mL链霉素；
[0014]S1012：羊膜载体的制备
[0015]取健康剖腹产孕妇胎盘、乙型、丙型肝炎病毒，霉素和HIV病毒检查阴性，在无菌条件下，生理盐水冲洗胎盘表面血迹，钝性分离羊膜，使用灭菌PBS缓冲液充分冲洗后，刮匙刮除残存的绒毛膜，采用200IU/ml青霉素和200IU/ml链霉素的PBS缓冲液反复冲洗，浸泡30min，分装于无菌甘油瓶中，置于
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20℃冰箱中冻存；
[0016]取出冻存羊膜片，室温下解冻，PBS缓冲液水化30min并冲洗3次后，0.25％胰蛋白酶消化液于37℃消化30min，刮除羊膜上皮细胞，PBS缓冲液清洗，剪成约20mm*20mm，贴附于制备的盖玻片上；
[0017]S1013：角膜缘组织的处理及取材
[0018]角膜缘组织经灭菌PBS缓冲液冲洗，去除多余的结膜组织及筋膜组织、角膜组织、内皮细胞、虹膜；PBS缓冲液冲洗，用含200IU/ml青霉素和200IU/mL链霉素的PBS缓冲液浸泡30min，取出角膜缘组织固定于解剖显微镜下，切取1
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1.5mm*2
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3mm大小的组织块，贴于制备的羊膜片上；
[0019]S1014：培养
[0020]切取的角膜缘组织块将上皮面向上贴附于羊膜载体上，于37℃、5％CO2代饱和湿度条件下进行培养，根据细胞生长代谢情况，每2
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3天更换培养液一次，逐日观察细胞生长情况。
[0021]优选地，在所述的S101中，间充质干细胞的分离和培养方法包括：
[0022]S1015：去取健康人体脐血、脐带、胎盘组织等(根据医院规定并经家属同意)，浸泡于DMEM中。超净台内取出组织，平衡液充分洗涤，并将其剪碎至2cm长度的小段；
[0023]S1016：将组织块移至1g/L的胶原酶Ⅱ中，加入少许DMEM，在37℃恒温震荡仪内消化，直至Wharton胶全部消化；
[0024]S1017：将含有细胞的消化液吸入无菌离心管，以30倍体积的DMEM反复吹打稀释，
1800r/m离心10min，弃上清液，用含150mL/L FBS的DMEM/F12的培养基清洗，使细胞悬液均匀分布，转至至普通培养瓶中，在37℃、150mL/L CO2培养箱内培养；
[0025]S1018：细胞贴壁后，第3天首次半量换液，弃去未贴壁细胞，以后每3
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4d换液一次。倒置相差显微镜下观察，细胞达80％融合后，用1.25g/L的胰酶消化，按1:2
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1:3的比例传代，续扩增培养。
[0026]优选地，在所述的S102中，包括以下步骤：
[0027](1)外泌体的制备：
[0028]收集上述培养上清液；
[0029](2)超滤法：
[0030]1)收集细胞上清本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种眼部递送改善视力的外泌体混合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S101：将人角膜缘干细胞和间充质干细胞分别培养，传代4次，并将其细胞培养基保存，用于分离外泌体；S102：使用超离心方法分离外泌体，并使用纳米颗粒跟踪分析(NTA)进行计数，混合物每mL含有2
×
10^9个外泌体，人角膜缘干细胞来源的外泌体与间充质干细胞来源的外泌体的比例为1:1。2.根据权利要求1所述的一种眼部递送改善视力的外泌体混合物的制备方法，其特征在于，在所述的S101中，人角膜缘干细胞的分离和培养方法包括：S1011：培养液的配制：基础培养基DMEM/F12内加入5ng/mL表皮生长因子、30ng/ml霍乱毒素、5μg/ml胰岛素、0.5mg/ml谷氨酰胺、20％胎牛血清、100IU/mL青霉素和100IU/mL链霉素；S1012：羊膜载体的制备取健康剖腹产孕妇胎盘、乙型、丙型肝炎病毒，霉素和HIV病毒检查阴性，在无菌条件下，生理盐水冲洗胎盘表面血迹，钝性分离羊膜，使用灭菌PBS缓冲液充分冲洗后，刮匙刮除残存的绒毛膜，采用200IU/ml青霉素和200IU/ml链霉素的PBS缓冲液反复冲洗，浸泡30min，分装于无菌甘油瓶中，置于
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20℃冰箱中冻存；取出冻存羊膜片，室温下解冻，PBS缓冲液水化30min并冲洗3次后，0.25％胰蛋白酶消化液于37℃消化30min，刮除羊膜上皮细胞，PBS缓冲液清洗，剪成约20mm*20mm，贴附于制备的盖玻片上；S1013：角膜缘组织的处理及取材角膜缘组织经灭菌PBS缓冲液冲洗，去除多余的结膜组织及筋膜组织、角膜组织、内皮细胞、虹膜；PBS缓冲液冲洗，用含200IU/ml青霉素和200IU/mL链霉素的PBS缓冲液浸泡30min，取出角膜缘组织固定于解剖显微镜下，切取1
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1.5mm*2
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3mm大小的组织块，贴于制备的羊膜片上；S1014：培养切取的角膜缘组织块将上皮面向上贴附于羊膜载体上，于37℃、5％CO2代饱和湿度条件下进行培养，根据细胞生长代谢情况，每2
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3天更换培养液一次，逐日观察细胞生长情况。3.根据权利要求1所述的一种眼部递送改善视力的外泌体混合物的制备方法，其特征在于，在所述的S101中，间充质干细胞的分离和培养方法包括：S1015：...

【专利技术属性】
技术研发人员：何文丽，
申请(专利权)人：上海中赛德康生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：