稳定遗传筛选元件及其构建方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种稳定遗传筛选元件的构建方法，包括先在宿主菌内敲除编码抗毒素MazE降解蛋白clpAP的基因clpP；然后再导入MazE补充质粒，同时敲除基因组中的基因mazE，即获得所述稳定遗传筛选元件。本发明专利技术还提供一种利用上述方法构建的稳定遗传筛选元件。本发明专利技术还提供一种生产目的产物的工程菌，包括上述稳定遗传筛选元件，该元件中导入了含有目的基因及mazE基因的质粒。本发明专利技术还提供一种上述工程菌在发酵培养中的应用。上述筛选元件及工程菌实现替代抗生素的筛选功能，避免了抗生素添加导致的污染以及成本增加，同时可以稳定传代，达到高效筛选的目的，对生物合成的工业化生产具有较大的应用前景。有较大的应用前景。有较大的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
稳定遗传筛选元件及其构建方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物工程
，具体涉及一种生物工程发酵过程中能替代抗生素的稳定遗传筛选元件及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]秉承绿色及可持续生产的理念，人们开始利用生物合成化工产品。在生物合成中，结构明确的质粒常被用来调节基因表达，通过不同蛋白酶的组合来生产不同的化工产品。质粒在长期遗传过程中容易丢失，目前人们常用抗生素作为生存压力，以此减少质粒的丢失。利用抗生素虽能保证菌株在传代过程中维持相对稳定的遗传，但是抗生素的添加有以下几方面的缺陷，一是在工业生产中，抗生素的添加增加生产成本；二是在工业发酵中添加抗生素，难以与终产物分离；三是由于工业废水含有抗生素，其排放之后易导致耐药菌株出现；四是抗生素筛选易出现假阳性；五是菌株通过抗性基因合成的物质来破坏抗生素，造成生产能量的浪费进而导致代谢负担。因此，研究生物合成过程中如何减少质粒丢失是生物合成工业化应用的一个重要研究方向。
[0003]目前常用的两种替代抗生素的筛选方法，一是染色体整合在基因组上直接调节遗传物质的表达，无需抗生素的参与，但是基因组上的表达强度不足，生产效率低下；二是利用缺陷型互补菌株进行筛选，基于必需基因敲除的缺陷型菌株需在不同表达载体的菌株中重复进行敲除；基于非必需基因敲除的缺陷型菌株需利用特定的培养基，不适合工业化生产。
[0004]所以，现有的能替代抗生素的筛选方法仍不能满足生物合成工业化生产的需要。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术有必要提供一种生物工程发酵过程中能替代抗生素的高效且稳定遗传筛选元件及其构建方法和应用。
[0006]在宿主菌中的程序性凋亡系统MazE
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MazF中，毒素蛋白MazF是一种序列特异性核酸内切酶，通过识别MazF的识别位点：单链mRNA的ACA 序列并进行切割，抑制蛋白质合成；抗毒素蛋白MazE与毒素蛋白MazF 形成复合体，使得MazF蛋白酶活性无法发挥作用。因此，当MazF单独存在时，MazF蛋白酶活性使得大肠杆菌体内很多蛋白质包括必需蛋白质无法合成，导致菌体死亡；当MazE与MazF同时存在时，MazF蛋白酶活性被抑制，宿主菌可以正常生长。本专利技术基于这一对程序性凋亡系统以及温敏质粒构建了一个能替代抗生素的高效且稳定传代的筛选元件。
[0007]具体地，本专利技术提供一种稳定遗传筛选元件，包括宿主菌，其中，该宿主菌中敲除了编码抗毒素MazE降解蛋白clpAP的基因clpP，还导入了抗毒素MazE温敏补充质粒，同时敲除了所述宿主菌基因组中编码mazE 的基因。
[0008]其中，基因clpP是编码抗毒素MazE降解蛋白clpAP的基因中的一种。
[0009]基于上述，所述抗毒素MazE温敏补充质粒为重组质粒pKD46
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mazE，且其中的pKD46
质粒的非功能基因区有一个XbaI酶切突变位点。其中，重组质粒pKD46
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mazE中的pKD46质粒为突变pKD46质粒，其相对于原始的pKD46质粒只改变了一个碱基，优选地，突变pKD46质粒是将原始 pKD46质粒中第5308位的碱基由A突变为G。
[0010]所述宿主菌为细菌或真菌，优选为，大肠杆菌、酵母菌或双歧杆菌等。更优选地，所述宿主菌为大肠杆菌K12系列。
[0011]本专利技术还提供一种上述稳定遗传筛选元件的构建方法，包括：
[0012]步骤一、先在所述宿主菌内敲除编码抗毒素MazE降解蛋白clpAP的基因clpP，构建减少MazE降解途径的第一菌株；
[0013]步骤二、然后在所述第一菌株中导入抗毒素MazE补充质粒，同时敲除所述宿主菌基因组中的mazE基因，即获得所述稳定遗传筛选元件。
[0014]基于上述，所述步骤一包括：利用CRISPER/Cas9系统敲除所述宿主菌中编码抗毒素MazE降解蛋白的基因clpP，使所述宿主菌体内的MazE 蛋白浓度足以中和其中的MazF的毒性作用，构建所述第一菌株。
[0015]基于上述，所述步骤二包括：将抗毒素mazE基因构建在具有RED同源重组功能的突变温敏质粒pKD46中，构建重组质粒pKD46
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mazE；将所述重组质粒pKD46
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mazE转进所述第一菌株，并应用RED同源重组技术以整合的方式敲除所述第一菌株基因组中的mazE基因片段，实现利用含有组成型启动子的mazF基因片段替换所述基因组上的mazE
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mazF基因片段，构建所述稳定遗传筛选元件。
[0016]本专利技术还提供一种目的产物工程菌，包括上述稳定遗传筛选元件，该稳定遗传筛选元件中导入了含有目的基因及抗毒素mazE的质粒。
[0017]其中，本文中的“目的基因”是指目的产物的生物合成途径中的酶的基因，且含有该目的基因的工程菌经过发酵培养可以直接合成目的产物。
[0018]本专利技术还提供一种上述目的产物工程菌的应用，包括：将所述目的产物工程菌在无抗生素环境中进行发酵培养。
[0019]基于上述应用，包括：按照体积比1％～2％的接种量，将所述目的产物工程菌接种到发酵培养基中，在37℃～42℃的条件下进行发酵培养，制得所述目的产物。
[0020]基于上述应用，所述发酵培养基包括10～40g/L碳源，1～5g/L酵母粉，0～2g/L MOPS，5～8g/L NaHPO4，0.3～2g/L NaCl，2～5g/L KH2PO4， 1～5g/L NH4Cl，240～250g/L MgSO4，14～15.5g/L CaCl2，溶剂为水，其中，碳源为葡萄糖、蔗糖和甘油中的一种或几种的混合。
[0021]基于上述，所述目的产物为肌醇、三七素、没食子酸、α
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熊果苷、β
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熊果苷或阿魏酸等可生物合成的物质。
[0022]因此，本专利技术提供的上述稳定遗传筛选元件是一株菌株，是通过对菌株中毒素
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抗毒素系统的利用，首先敲除抗毒素降解蛋白的合成基因clpP，然后构建一个含有抗毒素的温敏质粒，用来补充基因组上抗毒素敲除之后的抗毒素，然后利用含有组成型启动子的mazF基因片段替换基因组上的 mazEF基因片段，最终成功构建一个能够稳定传代且高效的替代抗生素的筛选系统。
[0023]本专利技术提供的目的产物工程菌通过在稳定遗传筛选元件中导入含有目的基因及抗毒素mazE的质粒来构建；30℃时，该目的产物工程菌体内同时存在含有抗毒素的温敏质
粒和目的质粒，该目的产物工程菌可以正常生长；42℃时，温敏质粒停止复制，仅含有抗毒素的目的质粒菌株可正常生长；如此，通过利用上述稳定遗传筛选元件构建的上述目的产物工程菌达到了替代抗生素实现筛选功能的目的。
[0024]所以，本专利技术提供的目的产物工程菌具有以下优点：
[0025]1)该目的产物工程菌的生产无需添加抗生素，即在不添加抗生素的状态下进行发酵，但其生产目的产本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种稳定遗传筛选元件，其特征在于：包括宿主菌，且该宿主菌中敲除了编码抗毒素MazE降解蛋白clpAP的基因clpP，还导入了抗毒素MazE温敏补充质粒，同时敲除了所述宿主菌基因组中的基因mazE。2.根据权利要求1所述的稳定遗传筛选元件，其特征在于：所述抗毒素MazE温敏补充质粒为重组质粒pKD46
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mazE，且其中的pKD46质粒的非功能基因区有一个XbaI酶切位点。3.一种权利要求1或2所述的稳定遗传筛选元件的构建方法，包括：步骤一、先在宿主菌内敲除编码抗毒素MazE降解蛋白clpAP的基因clpP，构建减少MazE降解途径的第一菌株；步骤二、然后在所述第一菌株中导入抗毒素MazE补充质粒，同时敲除所述宿主菌基因组中的mazE基因，即获得所述稳定遗传筛选元件。4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于：所述步骤一包括利用CRISPER/Cas9系统敲除所述宿主菌中编码抗毒素MazE降解蛋白clpAP的基因clpP，使所述宿主菌体内的MazE蛋白浓度足以中和其中的MazF的毒性作用，构建所述第一菌株。5.根据权利要求3或4所述的构建方法，其特征在于：所述步骤二包括将抗毒素mazE基因构建在具有RED同源重组功能的突变温敏质粒pKD46中，构建重组质粒pKD46
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mazE；将所述重组质粒pKD46
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mazE转进所述第一菌株，并应用R...

【专利技术属性】
技术研发人员：申晓林，付欢欢，童贻刚，袁其朋，王佳，孙新晓，
申请(专利权)人：北京化工大学，
类型：发明
国别省市：