同步检测DNA甲基化和miRNA的方法及应用技术

本发明专利技术属于检测技术领域，涉及同步检测DNA甲基化和miRNA的方法及应用，所述方法采用多色荧光PCR体系进行检测，所述多色荧光PCR体系包括DNA甲基化扩增荧光检测系统和miRNA扩增荧光检测系统；所述DNA甲基化扩增荧光检测系统包括至少1对扩增荧光引物对，所述扩增荧光引物对中引物对的上游引物或下游引物中的一个在靠近引物两端的位置分别标记有第一荧光基团和第一淬灭基团；所述miRNA扩增荧光检测系统包括至少1对扩增引物对和对应数量的荧光探针，所述荧光探针在5

【技术实现步骤摘要】
同步检测DNA甲基化和miRNA的方法及应用


[0001]本专利技术属于检测
，涉及一种在单个反应管中同步检测多个DNA甲基化标志物和miRNA标志物的方法及其应用。

技术介绍

[0002]DNA甲基化和miRNA是常见的表观遗传学修饰类型，它们与疾病的发生、发展、调控等有着明确的相关性，尤其是在一些恶性肿瘤的原癌基因调控或抑癌基因失活等通路上发生着重要作用。因此，目前DNA甲基化和miRNA是两种在疾病诊断/筛查使用中的常见的新型生物标志物。
[0003]相对于其他类型的生物标志物，DNA甲基化是一种更加稳定，特异性更强且可进行器官溯源的生物标志物。它不仅可以在组织中被检测到，也可以通过游离核酸(cell
‑
free DNA，cfDNA)的形式释放到血液、唾液、尿液、粪便、脑脊液等体液中，实现非侵入性的检测。目前，已有一些基于血液、粪便或尿液的DNA甲基化检测试剂盒获得了FDA或NMPA批准，用于疾病的筛查或早期诊断。但是，由于释放到体液中的cfDNA量相对较少，因此在早期癌症阶段尤其是癌变病变阶段时的灵敏度相对较低。
[0004]miRNA是一种片段长度仅为19
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24nt的微小核酸片段，与DNA甲基化类似，它不仅存在于组织中，也广泛存在于各种体液中，因此也可以作为一种非侵入性疾病诊断或筛查标志物。与DNA甲基化不同的是，miRNA在体液中载量相对更加丰富，尤其是不同癌症分期阶段的灵敏度较为一致。但是由于其序列较短，因此特异性相对较差。
[0005]由于疾病普遍存在异质性，单一类型的标志物检测通常存在一定的偏好性，而将多种标志物进行组合检测后不仅可以提升灵敏度，还可以消除个体之间的异质性偏好。基于以上背景，我们认为将DNA甲基化和miRNA组合进行检测和应用，不仅可以提高对早期疾病的灵敏度，还可以组合优化判断阈值，兼顾得到一个较好的特异性，达到更好的检测效果。然而，由于当前DNA甲基化和miRNA的常用检测体系存在不同，DNA甲基化检测需要使用亚硫酸盐转化后的DNA作为模板，而miRNA需要使用逆转录后cDNA作为模板，DNA序列和miRNA序列的长度及目标位点存在较大差异；同时，由于荧光定量PCR的荧光通道数通常为4
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5个，而多重DNA甲基化检测和多重miRNA检测都需要对各个靶标进行分型，常用的Taq探针法在相同的荧光通道下只能对一种靶标进行分型，分型数量很难突破荧光通道的数量。因此DNA甲基化和miRNA都是单独作为一种类型生物标志物进行检测和应用的，尚无一种技术可以同步检测DNA甲基化和miRNA。

技术实现思路

[0006]本专利技术旨在提供了一种可以在一管反应中同时检测miRNA和DNA甲基化的方法和技术，用于解决当前尚无同步法检测DNA甲基化和miRNA的现状，该技术具有检测速率更快，成本更低等优势。
[0007]本专利技术提供的技术方案如下：
[0008]同步检测DNA甲基化和miRNA的方法，所述方法采用多色荧光PCR体系进行检测，所述多色荧光PCR体系包括DNA甲基化扩增荧光检测系统和miRNA扩增荧光检测系统；
[0009]所述DNA甲基化扩增荧光检测系统包括至少1对扩增荧光引物对，所述扩增荧光引物对中引物对的上游引物或下游引物中的一个在靠近引物两端的位置分别标记有第一荧光基团和第一淬灭基团，第一荧光基团包含且不限于FAM，JOE,VIC,ROX,CY3,CY5,TAMRA,CY5.5,Texas Red；第一淬灭基团包含且不限于BHQ1,BHQ2,TAMRA,MGB。
[0010]所述miRNA扩增荧光检测系统包括至少1对扩增引物对和对应数量的荧光探针，所述荧光探针在5
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端标记第二荧光基团，3
’
端标记第二淬灭基团，且不同荧光探针标记的荧光基团不同。第二荧光基团包含且不限于FAM，JOE,VIC,ROX,CY3,CY5,TAMRA,CY5.5,Texas Red；第二淬灭基团为MGB。
[0011]进一步的，第一淬灭基团修饰距离末端碱基距离不少于3个碱基，与第一荧光基团的距离不少于10个碱基；若不同的荧光引物修饰同样的荧光基团，两条荧光引物之间的Tm差值不少于10。
[0012]进一步的，所述扩增荧光引物对的每1条引物都包含至少1个CpG位点。
[0013]进一步的，所述扩增荧光引物对的每1条引物包含至少2个CpG位点，且其中1个CpG位点位于靠近3
’
端第1
‑
3个碱基内。
[0014]进一步的，所述扩增荧光引物对均是针对甲基化修饰将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶的DNA序列设计的引物，甲基化修饰方法为亚硫酸盐或亚硫酸氢盐转化。
[0015]进一步的，第一淬灭基团修饰在碱基T上，且与第一荧光基团相邻的碱基不能为G。
[0016]进一步的，所述miRNA扩增荧光检测系统中扩增引物对的正向引物为一段与逆转录后miRNA的cDNA互补配对序列及一段随机序列组成的连续序列；所述miRNA扩增荧光检测系统中扩增引物对的反向引物为与逆转录引物颈环结构互补配对的序列；所述的荧光探针为MGB修饰探针。
[0017]进一步的，所述miRNA扩增荧光检测系统中在使用前先对miRNA进行逆转录，所述的逆转录引物为颈环法逆转录引物，所述逆转录引物包含如GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC所述的颈环结构序列。
[0018]进一步的，所述多色荧光PCR体系包括DNA甲基化扩增荧光检测系统、miRNA扩增荧光检测系统、DNA聚合酶、Mg
2+
溶液、dNTPs混合液、去离子水和PCR缓冲液，上述组分均设置于同一个反应管中。
[0019]进一步的，所述方法包括以下步骤：
[0020]a)提取DNA和miRNA；
[0021]b)亚硫酸盐转化DNA并纯化DNA；
[0022]c)逆转录miRNA；
[0023]d)将转化后的DNA和逆转录后的miRNA为模板，以及上述DNA甲基化扩增荧光检测系统和miRNA扩增荧光检测系统加入含有DNA聚合酶，Mg
2+
溶液，dNTPs混合液，去离子水，PCR缓冲液的同一个反应管中；
[0024]e)在实时荧光定量扩增过程中检测miRNA和DNA甲基化的荧光信号。
[0025]本专利技术还提供上述DNA甲基化和miRNA同步法检测方法在制备疾病诊断和筛查试剂中的应用。尤其是在制备癌症早期诊断和筛查制剂中的应用，所述癌症包括但不限于消
化道肿瘤，所述消化道肿瘤包括但不限于食管癌、胃癌、肠癌等。
[0026]有益效果
[0027]本专利技术所述方法可以在一管反应中同时检测miRNA和DNA甲基化，具有较高的灵敏度和特异性，还具有检测速率更快，成本更低等优势。相对于单独检测miRNA和DNA甲基化，其检测效率提升了至本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.同步检测DNA甲基化和miRNA的方法，其特征在于，所述方法采用多色荧光PCR体系进行检测，所述多色荧光PCR体系包括DNA甲基化扩增荧光检测系统和miRNA扩增荧光检测系统；所述DNA甲基化扩增荧光检测系统包括至少1对扩增荧光引物对，所述扩增荧光引物对中引物对的上游引物或下游引物中的一个在靠近引物两端的位置分别标记有第一荧光基团和第一淬灭基团；所述miRNA扩增荧光检测系统包括至少1对扩增引物对和对应数量的荧光探针，所述荧光探针在5
’
端标记第二荧光基团，3
’
端标记第二淬灭基团，且不同荧光探针标记的荧光基团不同。2.根据权利要求1所述的同步检测DNA甲基化和miRNA的方法，其特征在于，第一淬灭基团修饰距离末端碱基距离不少于3个碱基，与第一荧光基团的距离不少于10个碱基；若不同的荧光引物修饰同样的荧光基团，两条荧光引物之间的Tm差值不少于10。3.根据权利要求1所述的同步检测DNA甲基化和miRNA的方法，其特征在于，所述扩增荧光引物对的每1条引物都包含至少1个CpG位点；优选的，所述扩增荧光引物对的每1条引物包含至少2个CpG位点，且其中1个CpG位点位于靠近3
’
端第1
‑
3个碱基内。4.根据权利要求1所述的同步检测DNA甲基化和miRNA的方法，其特征在于，所述扩增荧光引物对均是针对甲基化修饰将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶的DNA序列设计的引物，甲基化修饰方法为亚硫酸盐或亚硫酸氢盐转化。5.根据权利要求1所述的同步检测DNA甲基化和miRNA的方法，其特征在于，第一淬灭基团修饰在碱基T上，且与第一荧光基团相邻的碱基不能为G。6.根据权利要求1所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵国栋，王凯，宋丽双，王小梅，
申请(专利权)人：苏州唯善生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：