一种特异性引物富集和纳米孔测序的非洲猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒实时检测方法技术

本发明专利技术涉及一种特异性引物富集和纳米孔测序的非洲猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒实时检测方法。本发明专利技术提供了针对纳米孔测序非洲猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒全基因组长PCR扩增的39对引物序列,促进纳米孔测序在相应病原微生物检测中的应用；本发明专利技术的检测方法可提升非洲猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒样本的检测灵敏度、特异度和测序覆盖度，尤其是在低滴度病毒感染的样本中；该检测方法能快速鉴别诊断非洲猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的感染，同时得到其全基因组序列，获得的基因组序列能为病毒溯源、病原变异追踪、新型毒株识别和预警等提供科学依据。新型毒株识别和预警等提供科学依据。新型毒株识别和预警等提供科学依据。

【技术实现步骤摘要】
一种特异性引物富集和纳米孔测序的非洲猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒实时检测方法


[0001]本专利技术属于微生物检测方法
，具体涉及一种特异性引物富集和纳米孔测序的非洲猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒实时检测方法。

技术介绍

[0002]公开该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
[0003]非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)引起的一种急性、烈性传染病。猪感染ASFV可表现出高热、呼吸障碍、全身出血、高死亡率等临床症状。ASFV基因组为线性双链DNA，基因组全长为170
‑
194kb。猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)俗称“猪蓝耳病”，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的严重病毒感染性疾病，以母猪繁殖障碍(怀孕母猪流产、木乃伊胎、死胎、弱仔)及仔猪与育成猪呼吸困难为主要特征。PRRSV是一种单股正链、不分节段的RNA病毒，基因组大小约15.4kb，分为欧洲型(PRRSV
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1)和美洲型(PRRSV
‑
2)。两种基因型具有显著的遗传差异，核苷酸序列的相似度约为55％
‑
70％。ASFV和PRRSV严重威胁生猪健康和稳定生产，对养猪业和世界猪肉产品贸易造成巨大的经济损失。ASFV和PRRSV可引起相似的临床症状和病理变化，包括高热、大出血、呼吸和生殖障碍等，仅凭临床症状无法准确区分这两种疫病。
[0004]对疑似ASFV和PRRSV感染进行快速鉴别诊断，并获得其基因组信息，能为病毒早发现、早控制、溯源提供依据，尽可能减小其对养猪业带来的经济损失。目前，对于病毒检测方法主要有病毒分离培养、免疫学检测及核酸检测，但上述三种方法均不能获得病毒的完整基因组序列，无法解析病毒基因组特征。纳米孔测序具有实时、便携、长读长、高通量等特点，可实现现场实时快速检测；然而，目前针对纳米孔测序优势设计的ASFV、PRRSV的长PCR引物较少，极大限制纳米孔测序应用于病原微生物的检测领域。综上，针对纳米孔测序的优势设计ASFV、PRRSV的长PCR扩增引物，并建立一套基于纳米孔测序平台实时检测ASFV和PRRSV的方法具有重要意义。

技术实现思路

[0005]本专利技术设计了ASFV和PRRSV全基因组长PCR扩增特异性引物，并进一步提供一种特异性引物富集和纳米孔测序的ASFV和PRRSV实时检测方法，充分发挥纳米孔测序在病原检测中实时、便携、长读长、高通量等优势。该检测方法可快速鉴别诊断ASFV和PRRSV的感染，同时得到其全基因组序列，获得的全基因组序列可为病原变异监控及分子流行病学研究提供信息。
[0006]为实现上述技术目的，本专利技术提供如下技术方案。
[0007]第一方面，本专利技术提供一种用于扩增ASFV和PRRSV全基因组的特异引物,共39对，序列如SEQ ID No.1和SEQ ID NO.68所示，其中，引物对A1包括ASFV
‑
F1(SEQ ID No.1)、ASFV
‑
R1(SEQ ID No.2)；引物对A2包括ASFV
‑
F2(SEQ ID No.3)、ASFV
‑
R2(SEQ ID No.2)；引物对A3包括ASFV
‑
F3(SEQ ID No.4)、ASFV
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R3(SEQ ID No.2)；引物对A4包括ASFV
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F4(SEQ ID No.5)、ASFV
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R4(SEQ ID No.2)；引物对A5包括ASFV
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F5(SEQ ID No.6)、ASFV
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R5(SEQ ID No.2)；引物对A6包括ASFV
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F6(SEQ ID No.7)、ASFV
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R6(SEQ ID No.2)；引物对A7包括ASFV
‑
F7(SEQ ID No.8)、ASFV
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F8(SEQ ID No.10)、ASFV
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R8(SEQ ID No.11)；引物对A9包括ASFV
‑
F9(SEQ ID No.12)、ASFV
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F11(SEQ ID No.16)、ASFV
‑
R11(SEQ ID No.17)；引物对A12包括ASFV
‑
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‑
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‑
F14(SEQ ID No.22)、ASFV
‑
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‑
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‑
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R19(SEQ ID No.33)；引物对A20包括ASFV
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F21(SEQ ID No.36)、ASFV
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R21(SEQ ID No.37)；引物对A22包括ASFV
‑
F22(SEQ ID N本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于扩增非洲猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒全基因组的特异引物，其特征在于，所述用于扩增非洲猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒全基因组的特异引物共39对,序列如SEQ ID No.1和SEQ ID NO.68所示，其中，引物对A1包括ASFV
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F1(SEQ ID No.1)、ASFV
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R1(SEQ ID No.2)；引物对A2包括ASFV
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F2(SEQ ID No.3)、ASFV
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R2(SEQ ID No.2)；引物对A3包括ASFV
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F4(SEQ ID No.5)、ASFV
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F5(SEQ ID No.6)、ASFV
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R6(SEQ ID No.2)；引物对A7包括ASFV
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R11(SEQ ID No.17)；引物对A12包括ASFV
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F12(SEQ ID No.18)、ASFV
‑
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F13(SEQ ID No.20)、ASFV
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R13(SEQ ID No.21)；引物对A14包括ASFV
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F16(SEQ ID No.26)、ASFV
‑
R16(SEQ IDNo.27)；引物对A17包括ASFV
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F17(SEQ ID No.28)、ASFV
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F24(SEQ ID No.42)、ASFV
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F25(SEQ ID No.42)、ASFV
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F26(SEQ ID No.42)、ASFV
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F27(SEQ ID No.42)、ASFV
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R27(SEQ ID No.46)；引物对A28包括ASFV
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F28(SEQ ID No.42)、ASFV
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R28(SEQ ID No.47)；引物对A29包括ASFV
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F29(SEQ ID No.42)、ASFV
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R29(SEQ ID No.48)；引物对P1
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1包括PRRSV1
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F1(SEQ IDNo.49)、PRRSV1
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2包括PRRSV1
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F2(SEQ ID No.51)、PRRSV1
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3包括PRRSV1
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F3(SEQ ID No.53)、PRRSV1
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R3(SEQ ID No.54)；引物对P1
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4包括PRRSV1
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F4(SEQ ID No.55)、PRRSV1
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R4(SEQ ID No.56)；引物对P1
‑
5包括PRRSV1
‑
F5(SEQ ID No.57)、PRRSV1
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R5(SEQ IDNo.58)；引物对P2
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1包括PRRSV2
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F1(SEQ ID No.59)、PPRRSV2
‑
R1(SEQ ID No.60)；引物对P2
‑
2包括PRRSV2
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F2(SEQ ID No.61)、PPRRSV2
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R2(SEQ ID No.62)；引物对P2
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3包括PRRSV2
‑
F3(SEQ ID No.63)、PPRRSV2
‑
R3(SEQ ID N...

【专利技术属性】
技术研发人员：许一菲，申园园，王玉昊，韦雪敏，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：