一种提高酶法制备纤维低聚糖得率的方法技术

一种提高酶法制备纤维低聚糖得率的方法，以底物原位吸附－固液分离法拆分纤维素酶系中的β－葡萄糖苷酶，通过固液分离除去大量β－葡萄糖苷酶后用于水解纤维质原料制备纤维低聚糖，其特征是采用分段水解的方法，在某一优选的分段时间点将水解物固液分离，分离所得的液相部分为纤维低聚糖液，向分离后的固相沉淀物中添加分离出的同等体积、ｐＨ值为４～６的水后继续水解，如此循环重复，直至酶水解结束。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属生物化学中的微生物酶解制糖
，具体涉及一种纤维质原料经生 物酶降解后，制备功能性食品或饲料添加剂一纤维低聚糖的技术。
技术介绍
低聚糖或称寡糖，是由2 10个单糖通过糖苷键连接而成的低聚合度糖类。低聚 糖分普通低聚糖和功能性低聚糖两类。功能性低聚糖是指具有特殊的生物学功能，尤其能 够显著促进人或动物肠道内双歧杆菌增殖，有益于人或动物健康的一类低聚糖，即所谓的 双歧因子。除了能够促进肠道内双歧杆菌等有益菌增殖外，功能性低聚糖另一个重要的生 物学功能是刺激人或动物体内的免疫系统，从而提高免疫力。功能性低聚糖主要作为添加 剂用于食品或饲料领域，近年来，随着人们对自身健康和动物食品安全的关注，功能性低聚 糖类食品或饲料添加剂的开发和应用越来越受到重视。功能性低聚糖的种类很多，目前进 入商业化的品种主要包括低聚异麦芽糖、低聚果糖、低聚壳聚糖、大豆低聚糖、帕拉金糖、低 聚木糖等。纤维低聚糖是由2 10个葡萄糖通过β -1，4-糖苷键结合而成的低聚合度糖类， 是功能性低聚糖的一种，纤维低聚糖主要是由纤维素经过化学或生物酶的方法制备。纤维素酶是水解纤维素成葡萄糖的一组酶的总称，它是一个多组分的复合酶系， 主要有三种组分即内切型葡聚糖酶、外切型葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶组成。纤维素可在 这三种酶组分的协同作用下彻底水解成葡萄糖。在纤维素酶水解过程中，内切葡聚糖酶以 随机形式切断纤维素链中的β-1，4-糖苷键，生成短链纤维素和纤维低聚糖；随后外切葡 聚糖酶主要作用于短链纤维素和纤维低聚糖的非还原末端，生成聚合度为2的纤维低聚糖 纤维二糖；最后，纤维低聚糖、尤其是纤维二糖，在葡萄糖苷酶的作用下彻底降解成葡 萄糖。从纤维素水解协同机理不难看出，如果纤维素酶系中葡萄糖苷酶的量越低， 则纤维素水解过程中中间产物纤维低聚糖进一步水解成葡萄糖的量则越少，纤维素水解成 纤维低聚糖的得率就越高，产品中无生理活性的单糖葡萄糖的比例就越少。在中国专利申 请200910035998. 8《一种微生物酶法生产纤维低聚糖新工艺》中，提供了一种将纤维质原料 中的纤维素选择性降解成功能性纤维低聚糖的方法，其特征是采用“底物原位吸附_固液 分离”的方法拆分纤维素酶系中的β "葡萄糖苷酶，严格控制底物与纤维素酶吸附的条件， 并通过固液分离法除去大量葡萄糖苷酶，用该拆分后的低葡萄糖苷酶活力纤维素 酶水解纤维质原料，可制得葡萄糖含量较低的纤维低聚糖。与未拆分处理的纤维素酶降解 法相比，纤维低聚糖得率提高，纤维低聚糖比例可达总糖的57. 63%。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对CN 200910035998. 8提供的方法中，低β -葡萄糖苷酶活力 纤维素酶在选择性降解纤维质原料制备纤维低聚糖时，纤维低聚糖得率仍然较低的不足，提出一种更为高效的纤维低聚糖制备工艺方法。纤维素酶是一种受反馈抑制的水解酶类，纤维素酶在水解纤维素过程中各酶组分 受到纤维素水解产物及其中间产物的反馈抑制。低葡萄糖苷酶活力纤维素酶在水解纤 维素制备纤维低聚糖过程中，由于水解体系中葡萄糖苷酶活力低而导致纤维素水解产 物中纤维低聚糖和纤维二糖的累积，有利于纤维低聚糖的制备。但累积的纤维低聚糖将对 内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶的活力产生反馈抑制作用，从而降低了水解效率和纤维低聚 糖的得率。如果在水解过程中采用某种方法将反应产生的纤维低聚糖及时移走，解除纤维 低聚糖对内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶的反馈抑制，就可以提高这两种酶的催化效率，从 而提高纤维低聚糖的得率。本专利技术的技术解决方案为，以底物 原位吸附-固液分离法拆分纤维素酶系中的葡萄糖苷酶，通过固液分离法除去大量 β “葡萄糖苷酶后用于水解纤维质原料，其特征是水解进行一段时间以后，将水解物固液分 离，分离所得的液相部分为纤维低聚糖液，向分离后的固相沉淀物中添加分离出的同等体 积、PH值为4 6的水后继续水解，如此循环重复，直至酶水解结束。可以采用两段水解的工艺，第一次水解6 18小时，第二次水解18 6小时，最 好采用10h+14h的水解分段法；也可以采用三段水解的工艺，第一、二次分别水解6小时，第三次水解12小时。适当增加水解的分段次数，理论上还可以提高纤维低聚糖的得率，但生产成本将 会增加。所述的方法中，纤维质原料可为木聚糖生产废渣、低聚木糖生产废渣、木糖渣、糠 醛渣，或经过适当预处理的纤维质原料，即以提高纤维质原料中纤维素对纤维素酶的可及 度所采用的物理、化学、生物或以上几种方法联合应用的方法。吸附和水解过程小规模在摇 瓶或往复式振荡器上进行，大规模在生物反应器、机械搅拌条件下进行；固液分离则可采用 离心固液分离法或板框过滤固液分离法。所用的纤维素酶，可由里氏木霉(Trichoderma reesei)、黑曲霉 (Aspergillusniger)、绿色木霉(Trichoderma viride)、康氏木霉(Trichoderma koningii)纤维素酶中的一种或多种提供。本专利技术的有益效果采用低β -葡萄糖苷酶活力纤维素酶选择性水解纤维质原料制备纤维低聚糖，将 水解过程分为若干个阶段，可以及时移除水解生成的产物纤维低聚糖，有效解除酶解产物 对纤维素酶的反馈抑制作用，从而有利于纤维低聚糖得率的提高。与低葡萄糖苷酶活 力纤维素酶选择性水解纤维质原料制备纤维低聚糖的不分段水解相比，采用两段水解法， 纤维低聚糖得率提高10%左右；采用三段水解法，纤维低聚糖得率提高20%左右。具体实施例方式以下一 三中所提及的方法，属本领域技术人员公知和已公开的技术。一、用里氏木霉制备纤维素酶1.里氏木霉(T. reesei)菌丝体培养基成分(g/L):葡萄糖10. 0 ；蛋白胨1. 0 ；硫酸 铵1. 4 ；尿素0. 3 ；磷酸二氢钾2. 0 ；无水氯化钙0. 3 ；七水硫酸镁0. 3 ；七水硫酸亚铁0. 005 ；七水硫酸锰0. 0016 ；七水硫酸锌0. 0014 ；氯化钴0. 002。培养基用0. 05mol/L的柠檬酸钠 缓冲液调节PH值4. 8。2.里氏木霉纤维素酶合成培养基成分(g/L):葡萄糖1. 0 ；纸浆10. 0 ；蛋白胨1. 0 ； 硫酸铵1. 4 ；尿素0. 3 ；磷酸二氢钾2. 0 ；无水氯化钙0. 3 ；七水硫酸镁0. 3 ；七水硫酸亚铁 0. 005 ；七水硫酸锰0. 0016 ；七水硫酸锌0. 0014 ；氯化钴0. 002。培养基用0. 05mol/L的柠 檬酸钠缓冲液调节PH值4. 8。3.里氏木霉菌丝体的培养50ml菌丝体培养基置于250ml三角瓶中，于121°C下 灭菌30min，冷却至室温，接入适量保藏于试管斜面的里氏木霉孢子，摇瓶置于恒温摇床中 于30 士 1°C、170转/分条件下培养36h后备用。4.里氏木霉纤维素酶的制备培养基于121°C下灭菌30min，冷却至室温，接入上 述培养36h的里氏木霉菌丝体，置于恒温摇床中于170转/分条件下培养，培养温度第一天 控制在30 士 1 °C，以后控制在28 士 1 °C。5.培养4天，用离心机在3000转/分条件下离心IOmin将培养液中的固体物质 (菌体和未被利用的纸浆纤维)分离除去，即得纤维素酶液。滤纸酶活力的测定采用国际理论和应用化学协本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提高酶法制备纤维低聚糖得率的方法，以底物原位吸附－固液分离法拆分纤维素酶系中的β－葡萄糖苷酶，通过固液分离除去大量β－葡萄糖苷酶后用于水解纤维质原料制备纤维低聚糖，其特征是水解进行一段时间以后，将水解物固液分离，分离所得的液相部分为纤维低聚糖液，向分离后的固相沉淀物中添加分离出的同等体积、ｐＨ值为４～６的水后继续水解，如此循环重复，直至酶水解结束。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：勇强，余世袁，王瑱瑱，徐勇，
申请(专利权)人：南京林业大学，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]