MDVTaqMan荧光定量PCR检测方法及组合物技术

本发明专利技术属于生物病原体检测技术领域，具体涉及一种MDV TaqMan荧光定量PCR检测方法及组合物。该组合物组合物含有用于检测马立克病病毒的引物和探针，具体包括，核苷酸序列依次如SEQ ID NO：1

【技术实现步骤摘要】
MDV TaqMan荧光定量PCR检测方法及组合物
[0001]优先权申请
[0002]本申请要求申请日为2023年05月08日、申请号为202310511276.5、专利技术名称为MDV TaqMan荧光定量PCR检测方法及组合物的中国专利技术专利的优先权，该优先权专利技术专利申请以引用方式全文并入。


[0003]本专利技术属于生物病原体检测
，具体涉及一种MDV TaqMan荧光定量PCR检测方法及组合物。

技术介绍

[0004]马立克病病毒(Marek's disease virus,MDV)是常见的导致家禽免疫抑制的产生肿瘤的病毒。家禽感染病毒后，造成机体免疫功能下降，不仅能够诱发淋巴瘤和神经障碍，更易受其他病原的并发或继发感染。近几十年以来，尽管养禽业实行了广泛的疫苗接种制度，但由于MDV对疫苗的免疫耐受不断加大，流行毒株也在不断进化，有更强的MDV突破现有疫苗的保护感染鸡群。马立克氏病已成为危害世界养禽业最严重的免疫抑制病与肿瘤病之一，给广大养殖户带来严重的经济损失，也使我国养禽业疾病预防控制治疗面临更高的风险挑战。
[0005]马立克病病毒的高效检测对禽类马立克氏病的预防、控制以及治疗的关键，然而在临床诊断过程中，常规PCR检测方法耗时长，且灵敏度、检测效率等方面还需提高。染料法荧光定量PCR检测快速、敏感性较高，但是易受到非特异性扩增和引物二聚体的影响，导致特异性不足。而TaqMan荧光定量PCR技术检测快速、敏感性较高，特异性更强，近年来被越来越多地应用于临床病原诊断上。
[0006]现有技术中，公开号为CN111733296A公开了一种检测马立克氏病病毒血清1型毒株的荧光定量PCR试剂盒及其在禽用生物制品质量控制中的应用。该试剂盒含有用于检测马立克氏病病毒血清1型毒株的一对特异性引物和相应的Taqman探针。然而该专利技术仅用于检测马立克氏病病毒血清1型，且检出限度为32.8copies/μL。

技术实现思路

[0007]有鉴于此，本专利技术的目的之一在于提供一种用于检测马立克病病毒的组合物，该组合物由用于检测马立克病病毒的引物和探针组成，本专利技术基于MDV序列保守区设计特异性引物，为后续MDV的感染检测提供了技术支持。
[0008]为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0009]用于检测马立克病病毒的组合物，所述组合物含有用于检测马立克病病毒的引物和探针，所述引物为核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的下游引物；所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
[0010]进一步，所述探针的5
′
端标记FAM荧光基团，3
′
端标记BHQ
‑
1淬灭基团。
[0011]本专利技术的目的之二在于提供一种所述用于检测马立克病病毒的组合物在制备用于检测马立克病病毒的试剂盒中的应用。
[0012]本专利技术的目的之三在于提供一种基于TaqMan实时荧光定量PCR技术检测马立克病病毒的方法，本专利技术的实时荧光定量PCR方法具有较好的特异性、灵敏度和稳定性，检测下限低至3.22
×
100copies/μL。
[0013]为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0014]基于TaqMan实时荧光定量PCR技术检测马立克病病毒的方法，所述方法为：提取待测样本的DNA，以所述DNA为模板，采用权利要求1中所述的引物和探针进行PCR扩增，根据测得的Ct值对待测样本进行定性和/或定量检测。
[0015]进一步，所述PCR反应体系为：qPCR TaqMan Probe Master MIX 10μL，上下游引物各0.4μL，探针0.4μL，DNA模板2μL，加灭菌超纯水至20μL。
[0016]进一步，所述上下游引物浓度为10μM；探针浓度为10μM。
[0017]进一步，PCR扩增程序为：95℃1min；95℃10s，59℃30s，循环45次；退火温度为59℃。
[0018]进一步，所述定量检测包括标准曲线的建立方法为：对MDV的重组标准质粒进行梯度稀释，以稀释后10个梯度的质粒标准品作为阳性模板，以双蒸水作为阴性对照，进行PCR扩增，得到标准曲线。
[0019]进一步，所述重组标准质粒进行10倍倍比稀释，拷贝数稀释为3.22
×
101‑
3.22
×
109copies/μL。
[0020]进一步，所述重组标准质粒的制备方法为：
[0021]提取病毒DNA，将提取的DNA用特异性引物(核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的下游引物)进行PCR扩增，PCR反应体系(20μL)：2
×
Taq PCR Master Mix聚合酶10μL，引物各1μL，DNA 2μL，ddH2O 6μL。PCR扩增程序：95℃预变性3min；95℃变性30s；60℃退火30s；72℃延伸1min，共35个循环，72℃延伸5min，4℃保存。经凝胶电泳后，将目的片段经胶回收后与pMD19
‑
T载体连接，转入DH5α感受态细胞中，放入37℃摇床增菌1h，将菌液涂布在含氨苄青霉素的LB固体培养基上过夜培养后挑选平板上的单个菌落进行纯化培养，经PCR鉴定后，提取质粒并进行测序，将测序正确的重组质粒作为阳性对照标准品。
[0022]进一步，将待测样本测得的Ct值代入标准曲线获得待测样品的浓度。
[0023]进一步，标准曲线方程为Y＝
‑
3.7X+44.02，R2＝0.996，Y为Y轴，表示Ct值，X为X轴，表示浓度。
[0024]本专利技术的目的之四在于提供一种用于检测马立克病病毒的TaqMan实时荧光定量PCR试剂盒，所述试剂盒含有目的一所述的用于检测马立克病病毒的组合物。
[0025]本专利技术的有益效果在于：
[0026]1.本专利技术基于MDV序列保守区设计特异性引物，建立操作简易、敏感性高、重复性好、特异性强的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法，可以实现临床上MDV的感染的有效检测。
[0027]2.本专利技术提供的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法，研究证实ALV、NDV、IBV、AIV、CIAV和阴性对照均没有出现特异性扩增曲线，表明本方法具有较好的特异性。
[0028]3.本专利技术的实时荧光定量PCR的检测下限为3.22
×
100copies/μL，表明本检测方
法具有极高的灵敏性。
[0029]4.本专利技术的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法，组内和组间变异系数均小于5.00％，具有良好的重复性。
附图说明
[0030]图1为MDV标准曲线图；
[0031]图2为MDV特异性试验结果图；
[0032]图3为MDV敏感性试验结果图，其中，1
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于检测马立克病病毒的组合物，其特征在于，所述组合物含有用于检测马立克病病毒的引物和探针，所述引物为核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的下游引物；所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述探针的5
′
端标记FAM荧光基团，3
′
端标记BHQ
‑
1淬灭基团。3.权利要求1
‑
2任一项所述的组合物在制备用于检测马立克病病毒的试剂盒中的应用。4.基于TaqMan实时荧光定量PCR技术检测马立克病病毒的方法，其特征在于，所述方法为：提取待测样本的DNA，以所述DNA为模板，采用权利要求1中所述的引物和探针进行PCR扩增，根据测得的Ct值对待测样本进行定性和/或定量检测。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，PCR反应体系为：qPCR TaqMan ...

【专利技术属性】
技术研发人员：温贵兰，刘蔓蔓，李波，文明，程振涛，杨颖，胡璇，孙芸，张潇，
申请(专利权)人：贵州大学，
类型：发明
国别省市：