一种合成10-HDA的方法技术

本发明专利技术提供了一种合成10

【技术实现步骤摘要】
一种合成10
‑
HDA的方法


[0001]本专利技术属于生物发酵
，具体涉及一种合成10
‑
HDA的方法。

技术介绍

[0002]10
‑
羟基
‑2‑
癸烯酸(10
‑
HDA)是一种既含有羟基，又含有羧基，还在α，β碳上有一个不饱和双键的特殊中链脂肪酸。10
‑
HDA具有抗菌、抗氧化、抗炎、免疫调节和抗肿瘤等独特的性能，具有较高经济价值。在自然界中，这种化学物质只存在于蜂王浆中，是一种独特的、高效的生物活性物质。反式
‑2‑
癸烯酸是生物合成10
‑
HDA的重要中间产物，可经末端羟基化后生成10
‑
HDA。除此之外，反式
‑2‑
癸烯酸还可作为药物中间体、作为配体合成高质量材料以及用于食品级香料的合成等。
[0003]然而，目前市面上10
‑
HDA的生产方法有物理萃取法和化学合成法。传统的物理提取方法是从蜂王浆或蜂胶中提取，但10
‑
HDA含量仅为1.4％～2.4％，提取步骤复杂，得率低；化学合成法包括Wittig试剂合成、臭氧化、溴化消除、Knoevenagel缩合、生长碳链合成等。生产反式
‑2‑
癸烯酸的方法也是通过醛醇缩合、wittig型反应或者对建立的羰基化合物脱氢等化学方法合成。然而化学合成方法容易产生环境污染和反应，且难以控制。因此市面上尚且无法大规模生产10
>‑
HDA，价格昂贵。研究者们致力于研究一种可大规模生产，不受资源限制的生产方法。生物催化合成法具有高度选择性、环境友好、生产周期短、不受资源限制、可大规模生产等优点，引起了人们的极大兴趣。
[0004]目前对于生物途径合成10
‑
HDA的报道较少，仅有两步法催化癸酸合成10
‑
HDA。但是中间产物反式
‑2‑
癸烯酸产量低以及分泌到胞外的反式
‑2‑
癸烯酸产量更少，限制了下一步反应的产率；另外对中间产物反式
‑2‑
癸烯酸的末端羟基化反应效率也阻碍了10
‑
HDA产品的高效合成。并且在制备反式
‑2‑
癸烯酸时，需要将菌体制备成静息细胞，操作步骤繁琐。

技术实现思路

[0005]针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种合成10
‑
HDA的方法。
[0006]本专利技术的目的在于提供一种高效合成10
‑
HDA的方法。
[0007]10
‑
羟基
‑2‑
癸烯酸，简称10
‑
HDA。
[0008]大肠杆菌工程菌BL21ΔFadB、R、J，pCDFDuet
‑1‑
MaMACS
‑
PpFadE、pET28a
‑
SUMO
‑
ctYdiI及该菌的构建方法是现有技术，已在专利文献CN113106109A中公开，具体参照第[00197]‑
[0221]段，专利名称：一种突变酶CPY153M228L及其在合成10
‑
羟基
‑2‑
癸烯酸中的应用，申请号：202110211118.9，公开日期2021.07.13。
[0009]本专利技术的技术方案如下
[0010]一种大肠杆菌BL21 pET
‑
28a
‑
CYP153A33/M228L
‑
CPRBM3
‑
GDH工程菌株，所述CYP153A33/M228L
‑
CPRBM3
‑
GDH的表达基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0011]一种大肠杆菌BL21 pET
‑
28a
‑
CYP153A33/M228L
‑
CPRBM3
‑
GDH工程菌株的构建方法，包括如下步骤：
[0012]①
构建重组质粒pET
‑
28a
‑
CYP153A33/M228L
‑
CPR
BM3
‑
GDH；
[0013]所述CYP153A33/M228L
‑
CPRBM3
‑
GDH的表达基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
[0014]②
利用步骤
①
制得的重组质粒pET
‑
28a
‑
CYP153A33/M228L
‑
CPRBM3
‑
GDH，转化到大肠杆菌BL21中，构建得到大肠杆菌BL21 pET
‑
28a
‑
CYP153A33/M228L
‑
CPRBM3
‑
GDH工程菌株。
[0015]根据本专利技术优选的，所述步骤
①
中，构建重组质粒pET
‑
28a
‑
CYP153A33/M228L
‑
CPRBM3
‑
GDH，包括如下步骤：
[0016]以大肠杆菌BL21 pET
‑
28a
‑
CYP153A33/M228L
‑
CPRBM3与枯草芽孢杆菌168的葡萄糖脱氢酶GDH融合酶基因为模板进行PCR扩增，CYP153A33/M228L
‑
CPRBM3的上游引物的核酸序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物的核酸序列如SEQ ID NO.3所示，GDH的上游引物的核酸序列如SEQ ID NO.4所示，下游引物的核酸序列如SEQ ID NO.5所示，然后将pET28a质粒用NdeI和XhoI进行双酶切，经多片段无缝克隆试剂盒连接，制得重组质粒pET
‑
28a
‑
CYP153A33/M228L
‑
CPRBM3
‑
GDH；
[0017]PCR扩增体系如下，总体系50μL；
[0018]100μM上游引物2.0μL,100μM下游引物2.0μL，模板2.0uL，5U/μL phanta酶25μL，ddH2019μL；
[0019]PCR扩增条件如下：
[0020]95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸CYP153A33/M228L
‑
CPRBM31min 34s，GDH 23s，循环30次，72℃延伸5min。
[0021]一种制备反式
‑2‑
癸烯酸的方法，包括如下步骤：
[0022](1)将大肠杆菌工程菌BL21ΔF本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种大肠杆菌BL21 pET
‑
28a
‑
CYP153A33/M228L
‑
CPRBM3
‑
GDH工程菌，所述CYP153A33/M228L
‑
CPRBM3
‑
GDH的表达基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.权利要求1所述大肠杆菌BL21 pET
‑
28a
‑
CYP153A33/M228L
‑
CPRBM3
‑
GDH工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
①
构建重组质粒pET
‑
28a
‑
CYP153A33/M228L
‑
CPR
BM3
‑
GDH；所述CYP153A33/M228L
‑
CPRBM3
‑
GDH的表达基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
②
利用步骤
①
制得的重组质粒pET
‑
28a
‑
CYP153A33/M228L
‑
CPRBM3
‑
GDH，转化到大肠杆菌BL21中，构建得到大肠杆菌BL21 pET
‑
28a
‑
CYP153A33/M228L
‑
CPRBM3
‑
GDH工程菌株。3.如权利要求2所述方法，其特征在于，所述步骤
①
中，构建重组质粒pET
‑
28a
‑
CYP153A33/M228L
‑
CPRBM3
‑
GDH，包括如下步骤：以大肠杆菌BL21 pET
‑
28a
‑
CYP153A33/M228L
‑
CPRBM3与枯草芽孢杆菌168的葡萄糖脱氢酶GDH融合酶基因为模板进行PCR扩增,CYP153A33/M228L
‑
CPRBM3的上游引物的核酸序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物的核酸序列如SEQ ID NO.3所示，葡萄糖脱氢酶GDH融合酶基因的上游引物的核酸序列如SEQ ID NO.4所示，下游引物的核酸序列如SEQ ID NO.5所示，然后将pET28a质粒用NdeI和XhoI进行双酶切，经多片段无缝克隆试剂盒连接，制得重组质粒pET
‑
28a
‑
CYP153A33/M228L
‑
CPRBM3
‑
GDH；PCR扩增体系如下，总体系50μL：100μM上游引物2.0μL,100μM下游引物2.0μL，模板2.0uL，5U/μL phanta酶25μL，ddH20 19μL；PCR扩增条件如下：95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸CYP153A33/M228L
‑
CPRBM3 1min 34s，GDH 23s，循环30次，72℃延伸5min。4.一种制备反式
‑2‑
癸烯酸的方法，包括如下步骤：(1)将大肠杆菌工程菌BL21ΔFadB、R、J，pCDFDuet
‑1‑
MaMACS
‑
PpFadE、pET28a
‑
SUMO
‑
ctYdiI培养至OD600为0.8
‑
1.2，加入乳糖与癸酸在20
‑
37℃，180
‑
200rpm培养条件下，继续培养10
‑
24h，得到中间培养物；(2)向步骤(1)的中间培养物中加入透性化试剂，在20
‑
37℃、180
‑
200rpm培养10
‑
24h后，制得含反式
‑2‑
癸烯酸的发酵反应液。5.如权利要求4所述方法，其特征在于，步骤(1)中，加入终浓度为0.5

【专利技术属性】
技术研发人员：苏静，王丽，王瑞明，王蕾蕾，李丕武，汪俊卿，王婷，
申请(专利权)人：齐鲁工业大学，
类型：发明
国别省市：